Deoxynukleotidtriphosphater (dNTP’er) er de essentielle byggesten i nukleinsyremolekyler og er som sådan nødvendige komponenter i PCR-blandinger, da der ikke kan dannes nyt (amplificeret) DNA uden dem. De fire individuelle deoxynukleotider, som udgør en DNA-sekvens (dvs. deoxyadenosintrifosfat, dATP; deoxythymidintrifosfat, dTTP; deoxycytosintrifosfat, dCTP; og deoxyguanosintrifosfat, dGTP) tilsættes normalt til PCR- og RT-PCR-blandinger i ækvimolære mængder, men hvis den DNA-målsekvens, der skal PCR-amplificeres, hovedsagelig består af dATP/dTTP (AT-forhold) eller hovedsagelig af dGTP/dCTP (GC-forhold), kan det molare forhold mellem de dNTP’er, der tilsættes til PCR-blandingen, ændres for at tage hensyn til denne ubalance. dNTP’er købes normalt enten enkeltvis eller som en (ækimolær) blanding fra kommercielle leverandører (f.eks. Roche, Promega osv.) og er kemisk stabile, når de opbevares i svagt alkaliske vandige opløsninger ved -20 °C. Det skal dog bemærkes, at dNTP’er er naturligt sure i opløsning; derfor kan det være nødvendigt at neutralisere arbejds- og lageropløsninger med alkaliske forbindelser før langtidsopbevaring. Neutraliserede dNTP-opløsninger justeres normalt til 10 mM stamopløsninger ved spektrofotometri eller ved at tilsætte den korrekte mængde sterilt vand til det frysetørrede produkt umiddelbart efter den kemiske syntese. Ved visse PCR’er kan det være en fordel at anvende stærkt rensede dNTP’er af “PCR-kvalitet” (Roche), som indeholder mindre end 0,9 % deoxynukleotiddiphosphater (dNDP), er >99 % rene og fri for forurenende stoffer som f.eks. modificerede nukleotider og tetrapyrophosphat. Disse (dyrere) dNTP’er med høj renhed kan være nyttige ved en vellykket amplifikation af PCR-DNA fra præparater, der indeholder et meget lavt antal kopier af mål-DNA.
I nogle PCR-applikationer og -protokoller kan en af de fire dNTP’er erstattes af en analog dNTP, f.eks. inosin, 7-deaza-2′ -deoxyguanosin, eller en modificeret dNTP, f.eks. en biotin-, fluorofor- eller radioaktivt mærket dNTP. Sådanne modifikationer gør det muligt at udføre yderligere downstream post-PCR-behandlinger.