Citrobacter freundii fitness under blodstrømsinfektion

Samling af Citrobacter BSI-isolater

Sammenlignet med andre Gram-negative arter, der regelmæssigt forårsager BSI, er der kun begrænset information om C. freundiis fysiologi i værtsmiljøet. Med det formål at afhjælpe denne mangel indsamlede vi først otte isolater tilhørende C. freundii-komplekset fra patienter med BSI inden for University of Michigan Health System. Ribosomal RNA-baseret fylogeni er i stand til at skelne mellem tre grupper af Citrobacter-arter, hvoraf gruppe I omfatter mindst otte arter og omfatter C. freundii23,24. 16S rRNA-sekvens- og massespektrometri-baserede identifikationsmetoder giver imidlertid en begrænset fylogenetisk opløsning inden for denne gruppe af Citrobacter-arter. Derfor blev de isolater, der blev anvendt i denne undersøgelse, vurderet yderligere ved hjælp af en multilocus-sekvensanalyse. Blandt de otte indsamlede isolater var seks af dem tæt forbundet med etablerede C. freundii-stammer (Fig. 1) og havde en gennemsnitlig nukleotididentitet på >98% med typestammen ATCC 8090, hvilket er over den typisk accepterede grænseværdi på 95% for isolater af samme art. Af de to resterende isolater klynger UMH17 sig tættest sammen med Citrobacter pasteurii-typestammen CIP 55.13 og UMH18 med Citrobacter werkmanii-stammer.

C. freundii-bakteriæmi

Forud for at undersøge Citrobacter’s fitnesskrav under BSI blev der udviklet en murin model for bakteriæmi baseret på tidligere arbejde med andre tarmkræftarter25. Blandt Citrobacter BSI-isolaterne blev stammerne UMH14 og UMH15 valgt som kandidater til brug i denne undersøgelse. Isolat UMH14 udviste en mere konsistent dosisafhængig kolonisering af milt og lever 24 timer efter injektion i halevenen (Fig. S1) og blev udvalgt til yderligere karakterisering. Det var også nødvendigt at teste infektionsmodellen for potentielle flaskehalse for kolonisering inden vurdering af de enkelte C. freundii-geners bidrag til fitness ved hjælp af en stor samling af transposonmutanter. En spontan nalidixinsyre-resistent mutant af UMH14 (UMH14Nal) blev isoleret og bestemt til at have tilsvarende in vitro-fitness under samdyrkning med moderstammen i rigt medium (Fig. S2). For at bestemme, om en forskelligartet population af mutanter kunne etableres i blodbanen uden stokastisk tab af individuelle kloner, blev UMH14Nal- og UMH14-stammerne blandet i forskellige forhold og inokuleret til mus. Efter 24 timer blev forhold på op til 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) tolereret uden spontant tab af den underrepræsenterede stamme i milten (Fig. S2), hvilket indikerer, at en enkelt mus kunne rumme mindst 10.000 unikke transposonmutanter ved en samlet dosis på 5 × 107 bakterier ved hjælp af denne model.

For at identificere Citrobacter fitnessgener i bakteriæmimodellen blev fem puljer af tilfældige transposonindsættelsesmutanter, der repræsenterer >44.000 unikke indsættelsessteder, injiceret i mus, og bakterier, der koloniserede milten, blev genvundet efter 24 timer (Fig. S3). Den relative hyppighed af individuelle transposonmutanter i inokulumet og miltudgangene, som bestemt ved højhastigheds-sekventering, blev brugt til at identificere gener, der bidrager til bakteriel overlevelse i modellen. I alt 177 transposon-forstyrrede gener gav et signifikant tab af fitness, og ni gener var forbundet med øget bakteriel fitness, når de var muteret (fold-ændring ≥2.0, Adj. P < 0.05) (Data S1) (Data S1). En anden analyse med dette datasæt identificerede 546 kromosomalt kodede putative essentielle gener, for hvilke antallet af læsninger i inputpopulationen var signifikant lavere end forventet baseret på tilgængelige TA-steder og bibliotekspopulationsstørrelsen (logFC <-5,17) (Data S2) (Data S2). Ved hjælp af denne model af opportunistisk og systemisk infektion blev det forventet, at størstedelen af de identificerede fitnessfaktorer ville repræsentere centrale fysiologiske processer snarere end prototypiske virulensfaktorer (f.eks. proteintoksiner eller adhæsiener). Faktisk afspejlede kategoriseringen af de 177 gener, der var forbundet med betydelige fitnessdefekter ved Clusters of Orthologous Groups (COG), at der overvejende var metaboliske veje og cellulære vedligeholdelsesfunktioner, der var nødvendige under C. freundii-bakteriæmi (Fig. 2). Omkring halvdelen af de identificerede fitnessgener passer bredt inden for fem COG-kategorier, der omfatter energiproduktion, aminosyremetabolisme, DNA-replikation og reparation, translation og cellevæg- og membranbiogenese.

Validering af individuelle fitnessgenmutanter

Bidraget fra individuelle genprodukter til C. freundii-fitness blev bekræftet med uafhængige deletions-indsættelsesmutationer konstrueret i udvalgte UMH14-gener (tabel 1). Alle konstruerede stammer, der er rapporteret her, manglede grove replikationsdefekter som bestemt ved vækst i rigt medium (Fig. S4). For hvert gen, der er anført i tabel 1, blev fitness målt ved at co-inficere individuelle mutanter med UMH14-moderstammen. Fem af de syv oprindeligt testede mutanter udviste en statistisk signifikant konkurrencemæssig ulempe i enten milt eller lever (Fig. 3A), hvorved resultaterne af transposon-screeningen blev bekræftet. ZnuB-mutanten blev valgt som en negativ kontrol til validering her, da resultaterne af transposon-screeningen viste, at der ikke var nogen fitnessdefekt forbundet med dette gen, på trods af beviser fra andre bakteriearter, der viser, at ZnuABC-zinktransportsystemet bidrager til infektion hos muriner26,27,28. I konkurrence med UMH14 udviste znuB-mutanten ikke en betydelig fitnessdefekt, hvilket er i overensstemmelse med de forventede resultater. De tilstødende znuA- (fold-ændring = 1,5, Adj. P = 0,527) og znuC- (fold-ændring = 2,0, Adj. P = 0,035) gener fra UMH14 gav også enten ingen fitnessdefekt eller en minimal defekt, når de blev muteret ved transposonindsættelse (Data S1).

Mutation af tatC-genet, der koder for en komponent i twin-arginin translokationssystemet, resulterede i det største tab af fitness blandt alle de testede mutanter (Fig. 3). For at afgøre, om den nedsatte fitness af denne mutant kunne genoprettes gennem genetisk komplementering, blev plasmidet pBBR1MCS-5, der bærer tatC open reading frame, introduceret i tatC-mutanten, og den relative fitness af den resulterende stamme blev testet. tatC-mutanten udviste oprindeligt en 67-dobbelt fitnessdefekt i milten i konkurrence med wildtypestammen (Fig. 3A), mens den komplementerede tatC-mutant kun udviste en to-dobbelt fitnessdefekt under de samme betingelser (Fig. 3B). På samme måde var den komplementerede tatC-mutant ikke signifikant udkonkurreret i leveren sammenlignet med UMH14. Moderplasmidet pBBR1MCS-5 er kendt for at blive stabilt vedligeholdt under infektion i fravær af selektion29 , og in vitro-kultur af C. freundii tatC-mutanten med enten pBBR1MCS-5 eller tatC+-komplementeringsplasmidet viste ikke noget mærkbart tab af plasmid i løbet af 24 timer i fravær af selektion (Fig. S5). Tilsammen fastslår disse resultater fast kravet om TatC-funktion under Citrobacter-bakteriæmi.

Konservering af fitnessgener blandt Citrobacter-isolater

I løbet af denne undersøgelse blev den komplette genomsekvens af hvert Citrobacter-isolat bestemt, og det forudsagte proteom for hver stamme blev sammenlignet med UMH14 som en reference. Af de 4.666 forudsagte genprodukter, der er kodet på UMH14-kromosomet, er 3.742 bevaret med ≥95 % identitet mellem alle C. freundii-isolater i denne undersøgelse (Fig. 4A). Antallet af konserverede proteiner (≥95% identitet) mellem alle stammer falder til 2.545, når de forudsagte proteomer af UMH17 og UMH18 blev inkluderet, hvilket er i overensstemmelse med placeringen af disse isolater uden for C. freundii-grenen ved multilocus-sekvensanalyse (fig. 1). Bevarelsen af UMH14 fitnessfaktorer var også høj, med 145 af de forudsagte 177 proteiner bevaret ved ≥95% aminosyreidentitet blandt de otte bakteriestammer (Fig. 4B), herunder alle syv af de oprindelige fitnessfaktorer, der blev udvalgt til validering (Tabel 1 og Fig. 3). Ved at fjerne UMH17 og UMH18 fra overvejelserne øgedes antallet af konserverede fitnessfaktorer til 162 (92 %). Disse resultater tyder på en Citrobacter-overlevelsesstrategi under bakteriæmi, som i høj grad er afhængig af konserverede proteiner inden for arten. Det er interessant, at få fitnessfaktorer var helt unikke (<30% identitet) for UMH14 inden for denne undergruppe af stammer. Et bemærkelsesværdigt eksempel er et formodet operon med tre gener (CUC46_23440-CUC46_23450) med observerede fitnessdefekter, der varierer mellem 6- og 14-foldigt. Alle tre åbne læserammer koder for hypotetiske proteiner, og blandt disse er det kun CUC46_23450, der forudsiges at kode for et konserveret domæne med en tildelt funktion (cd01713, phosphoadenosinphosphosulfatreduktase).

DNA-rekombinations- og reparationsveje

Et af målene med denne undersøgelse var at identificere konserverede biologiske veje, der involverede flere bakteriefitnessfaktorer. RecBCD- og RuvABC-enzymkomplekserne, der er involveret i DNA-rekombination og -reparation, udgør et sådant eksempel. RecBCD-enzymet er aktivt på duplex-DNA-ender og er nødvendigt for homologe rekombinationsprocesser og rekombinations-DNA-reparation. I tilknytning til disse funktioner letter RuvABC-enzymet Holliday junction-grenmigrationen og opløsningen30,31. Transposonindsættelse i enten recB, recC eller recD resulterede i en 6-8-dobbelt reduktion i fitness, og på samme måde resulterede disruption af både ruvA og ruvC ved transposonindsættelse i et >30-dobbelt tab af fitness (Data S1). Det er vigtigt, at ruvA-fitnessdefekten blev bekræftet ved konkurrenceinfektion mod wildtypestammen ved hjælp af en uafhængigt konstrueret mutant (Fig. 3A). Inden for de to multiproteinkomplekser var det kun RuvB, der ikke blev identificeret som en betydelig fitnessfaktor i vores datasæt. Begge proteinkomplekser er kendt for at deltage i opløsningen af fastlåste eller kollapsede DNA-replikationsgafler, der opstår under normal kromosomal syntese30, selv om det er vigtigt, at ruvA-mutanten voksede på samme måde som vildtypestammen under hurtig replikation i rigt medium (Fig. S4). Det er fristende at spekulere i, at bakteriel DNA-skade, der opstår i værtsmiljøet, potentielt gennem immuncelle-medieret produktion af reaktive oxygenarter, også kan bidrage til kravet om disse komplekser.

Det dobbelte-arginin translokationssystem

Det dobbelte-arginin translokationssystem fungerer i Gram-negative bakteriearter til at udskille foldede proteiner over den cytoplasmiske membran. TatC’s rolle i dette bevarede multiproteinsystem er at genkende sekretionssignalsekvenser for proteiner, der eksporteres gennem denne vej. Efter at have fastslået tatC-genets betydelige indvirkning på C. freundiis in vivo fitness (fig. 3), blev det antaget, at proteiner, der udskilles af Tat-systemet, også kan være nødvendige for fitness i murinmodellen. For at identificere formodede Tat-sekreterede proteiner blev den N-terminale sekvens af hver af de 177 fitnessfaktorer analyseret ved hjælp af TatP 1.0-prædiktionssoftwaren32. To gener, CUC46_16565 og CUC46_1606060, blev identificeret som kodende for Tat-afhængige signalpeptider, der indeholder twin-argininmotiver. CUC46_16565-produktet har 94 % aminosyreidentitet med E. coli SufI-proteinet, herunder 100 % bevarelse af twin-arginin-motivet og den hydrofobiske del af signalpeptidet33. C. freundii sufI-genet blev muteret, og fitness blev vurderet i konkurrence med UMH14-moderstammen for at afgøre, om noget af fitnessdefekten i forbindelse med tabet af TatC kunne tilskrives forstyrrelse af SufI-funktionen (fig. 5A). Faktisk blev sufI-mutantstammen udkonkurreret 7-foldigt i milten og 17-foldigt i leveren sammenlignet med wildtypestammen. Men da fitnessomkostningerne ved tatC-mutationen varierede fra 67-fold til 112-fold i konkurrence med wild-type bakterier (Fig. 3), indebærer de forholdsvis lave fitnessomkostninger ved sufI-mutationen, at yderligere Tat-afhængige substrater også kan bidrage til fitness. Forsøg på at etablere Tat-afhængig sekretion af SufI i C. freundii mislykkedes på grund af tilsyneladende toksicitetsproblemer i forbindelse med ekspression af et C-terminalt FLAG epitiope-markeret SufI-konstrukt, specielt i tatC-mutantstammen (data ikke vist). SufI er imidlertid blevet anvendt som et model Tat-secreted protein i talrige undersøgelser, der karakteriserer E. coli Tat-systemet.

Den anden potentielle Tat-secreted fitnessfaktor, der blev identificeret, og som er kodet af CUC496_1606060, er en forudsagt prolinaminopeptidase (PRK10879), der tilhører PepP-superfamilien. En mutantstamme, der manglede pepP-genet, blev udkonkurreret ca. 3 gange i milten og ca. 2 gange i leveren, men den observerede fitnessulempering i forhold til wild-type var ikke statistisk signifikant (Fig. 5A). Ikke desto mindre blev den subcellulære lokalisering af PepP bestemt ved hjælp af et C-terminalt FLAG-epitopmærket derivat, der blev båret på et multikopieret plasmid (PepPFLAG). Der blev påvist uventet lave niveauer af PepPFLAG i tatC-mutanten sammenlignet med UMH14; PepPFLAG-fusionsproteinet blev imidlertid primært fundet i den cytoplasmatiske fraktion af begge testede stammer (Fig. S6), og der blev ikke fundet noget bevis for Tat-afhængig subcellulær lokalisering af PepP-proteinet. Sammen med sufI-mutantkonkurrenceinfektionsresultaterne understøtter disse data yderligere den opfattelse, at yderligere Tat-afhængige fitnessfaktorer er til stede i C. freundii, eller at det kumulative tab af proteintranslokation via Tat-systemet opvejer tabet af funktion for et enkelt substrat.

En af de fremherskende fænotyper, der er forbundet med tab af funktion tat-mutanter på tværs af arter, er en forringelse af motilitet34,35,36,37. C. freundii er en flagelleret bakterie, der er i stand til at svømme motilitet i en blød agar-matrix. C. freundii tatC-mutanten udviste en ca. 2-dobbelt reduktion i svømmemotilitet sammenlignet med wildtypestammen, og svømmemotiliteten blev fuldt ud genoprettet ved genetisk komplementering i trans (fig. 5B,C). Disse resultater viser klart en motilitetsdefekt i fravær af TatC-funktion; men da der stadig blev observeret svømning på lavt niveau i tatC-mutanten, er en vis flagellarfunktion sandsynligvis bevaret. Med undtagelse af fliQ tyder den generelle mangel på flagella-associerede fitnessgener, der er identificeret under bakteriæmi, på, at tatC’s betydning for C. freundii fitness kan være stort set uafhængig af den flagelladysfunktion, der er observeret i denne stamme.

Metaboliske fitnessveje

Som tidligere nævnt blev en betydelig del af de identificerede Citrobacter fitnessgener forudsagt til at fungere i metaboliske veje (Fig. 2). Tre forskellige gener, der repræsenterer komponenter af central kulstofmetabolisme (pfkA), fruktose- og mannosemetabolisme (mtlD) og aminosyrebiosyntese (cysE), blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Bakteriel cysteinbiosyntese sker fra L-serin gennem mellemproduktet O-acetyl-L-serin (OAS). Dette første trin i E. coli-modelvejen katalyseres af enzymet CysE O-acetyltransferase, og tab af cysE resulterer i en cystein-auxotrofi38,39. En C. freundii cysE-mutant er ligeledes ude af stand til at replikere i et defineret medium uden cystein (fig. 6A), men kan opnå tæt på den normale tæthedsgrad, når mediet blev suppleret med enten OAS (fig. 6B) eller cystein (fig. 6C). Genetisk komplementering af cysE-mutationen resulterede i en delvis genoprettelse af væksten i fravær af cystein. Det er interessant, at den fuldstændige mangel på vækst for cysE-mutante bakterier i fravær af OAS eller cystein in vitro står i modsætning til den delvise fitnessdefekt, der blev observeret under infektion (Fig. 3A). Dette tyder på, at Citrobacter kan være i stand til at få disse metabolitter fra blodomløbsmiljøet, men at der stadig er en fitnessomkostning forbundet med forstyrrelse af den biosyntetiske vej.

Som en del af vores undersøgelse af Citrobacter’s værtsassocierede metabolisme blev denne bakteries evne til at udnytte forskellige kulstofkilder undersøgt. PfkA-enzymet phosphofructokinase fra andre enteriske arter er blevet udførligt karakteriseret og repræsenterer det første engagerede trin i glykolysen, idet det katalyserer fosforyleringen af fruktose-6-fosfat til fruktose-1,6-bisfosfat. For UMH14 eliminerede mutation af pfkA denne stammes evne til at replikere på glukose som eneste kulstofkilde (Fig. 6D), hvilket kunne genoprettes delvist ved at tilvejebringe pfkA på et multikopieret plasmid. Dette totale tab af glukoseudnyttelse in vitro korrelerede med et to-dobbelt fald i fitness under bakteriæmi (Fig. 3A). Da glukose er en rigelig kulstofkilde i serum fra pattedyr40 , er disse resultater i overensstemmelse med en rolle for Citrobacter udnyttelse af glukose under infektion, men tyder også på, at Citrobacter’s metaboliske repertoire kan lette udnyttelsen af alternative kulstof- og energikilder.

En anden enzymatisk aktivitet, der involverer fructose-6-fosfat, blev også undersøgt for bidrag til Citrobacter bakteriæmi. Mannitol-1-fosfat-5-dehydrogenaseproteinet, MtlD, letter den bidirektionelle omdannelse af mannitol-1-fosfat og fruktose-6-fosfat ved hjælp af NAD+ eller NADH som en co-faktor41,42. Flere tarmbakteriearter kan udnytte sukkeralkoholen mannitol som eneste kulstofkilde efter transport via et hexitolphosphoenolpyruvat-afhængigt phosphotransferasesystem, hvilket resulterer i intracellulær akkumulering af mannitol-1-fosfat43,44. En mulig skæbne for mannitol-1-fosfat er MtlD-afhængig oxidation til fructose-6-fosfat og efterfølgende indledning i den glycolytiske vej. C. freundii mtlD-mutanten udviste et femdobbelt fald i fitness i murinleveren (Fig. 3A), og denne observation gav anledning til eksperimenter for at afgøre, om C. freundii var i stand til denne type metabolisme in vitro. UMH14- og mtlD-derivatstammer blev dyrket i defineret medium indeholdende mannitol, og de resulterende vækstkurver viser, at wild-type-bakterier og den komplementerede mutant var i stand til at proliferere under disse betingelser, mens mtlD-stammen ikke kunne (Fig. 6E). Som forventet var mtlD-mutanten i stand til at formere sig til næsten wild-type-niveauer, når den fik glukose som kulstofkilde under aerobe forhold (Fig. 6F). Tilsammen fastslår disse resultater både C. freundiis evne til at udnytte mannitol som eneste kulstofkilde og kravet til mtlD i denne proces.

Delte fitnessstrategier mellem patogener i blodkredsløbsmiljøet

Vi har tidligere vurderet fitnesskravene hos et andet opportunistisk patogen, S. marcescens, ved hjælp af en lignende murin model af bakteriæmi. Resultaterne af S. marcescens-undersøgelsen omfattede identifikation af 212 fitnessgener ved hjælp af teknikker, der svarer til det foreliggende arbejde45. I et forsøg på at afgøre, om disse arter har fælles veje til fitness under BSI, blev de forudsagte proteomer af de to arter først sammenlignet. Proteiner blev betragtet som homologer mellem C. freundii og S. marcescens, hvis de delte ≥70% aminosyreidentitet over ≥50% af sekvensen. I alt blev 42 homologe proteiner identificeret som signifikante fitnessfaktorer i begge organismer (tabel S1) med en række forskellige funktioner er repræsenteret i denne liste over fælles fitnessfaktorer. Især blev RuvA-proteinet, hvis tab resulterede i et >10-foldigt fald i C. freundii-fitness ved konkurrenceinfektion (Fig. 3A), identificeret sammen med RuvC som fitnessfaktorer i S. marcescens. Disse resultater understøtter yderligere hypotesen om, at opløsning af Holliday junction-komplekser, potentielt under rekombinationel reparation af DNA-skader, er vigtig for disse organismers in vivo fitness. PfkA-enzymet phosphofructokinase blev også identificeret som en fitnessfaktor hos begge arter. Som det blev observeret med Citrobacter, er S. marcescens pfkA påkrævet for udnyttelse af glukose som eneste kulstofkilde, og var desuden påkrævet for optimal bakteriel replikation i varmeinaktiveret humant serum45. I begge organismer bidrog pfkA til fitness i milten som vurderet ved transposon-screening, men interessant nok udviste S. marcescens pfkA-mutanten også ca. 9 gange reduceret fitness i nyren ved konkurrenceinfektion med wildtypestammen. I forbindelse med dette arbejde blev det observeret, at C. freundii UMH14-wildtypestammen udviste en relativt dårlig kolonisering af nyrerne i BSI-modellen, men pfkA-genet hos Proteus mirabilis er blevet vist at bidrage til fitness i nyrerne efter urinvejsinfektion46. Tilsammen viser disse resultater, at det er muligt at identificere bevarede fitnessstrategier på tværs af organismer inden for et specifikt miljø. Der vil være behov for yderligere arbejde for at afgøre, om disse genprodukter også er nødvendige i andre BSI-fremkaldende organismer, og om disse bevarede fitnessveje kan udnyttes.