Den 4. december besøgte jeg Clinic for Special Children i hjertet af Pennsylvania Dutch Country, hvor et lille personale tager sig af mere end 2000 patienter med en række forskellige arvelige sygdomme. I sidste uges indlæg beskrives en familie, hvor 5 ud af 6 børn har en anfaldssygdom med autistiske træk. Undersøgelsen af dette syndrom i løbet af de sidste 15 år illustrerer på smukt vis udviklingen af metoder til genopdagelse, før sekventering katapulterede os ind i en ny teknologisk tidsalder. (Advarsel: jargon forude.)
KONTAKTERING AF FENOTYPE TIL GENOTYPE
I dag sammenligner forskerne for at identificere genet bag en udiagnosticeret tilstand hos et barn exomsekvenser (den del af genomet, der koder for proteiner) fra forældre og eventuelt søskende for at identificere de forårsagende genvarianter (alleler). Det går hurtigt.
I tiden før genomet fulgte forskerne en indirekte vej fra fænotype til genotype:
– De konstaterede, at symptomerne “ligger i familier”.
– De fandt, at tilstanden var mere almindelig blandt enæggede tvillinger end tveæggede tvillinger og blandt søskende til patienter end i den almindelige befolkning.
– De identificerede unormale kromosomer hos personer med tilstanden.
– Brug af genombaserede associationsundersøgelser (GWAS) til at identificere mønstre af genetisk variation (på sæt af enkeltbasepladser kaldet enkeltnukleotidpolymorfismer eller SNP’er), der kan markere en sygdomsfremkaldende variant.
– Identifikation af genet og fremstilling af en musemodel til afprøvning af behandlinger.
Da amish-folket forlod Schweiz i begyndelsen af 1700-tallet for at undslippe religiøs forfølgelse og bosatte sig i Pennsylvania, medbragte de et udsnit af den europæiske genpulje. Ved at formere sig indbyrdes forstærkedes mutationer og resulterede i “runs of autozygosity” i deres genomer – sektioner af kromosomer, der har de samme DNA-sekvenser på begge kopier. Autozygositetsforløb viser, at to slægtninge har arvet et sæt genvarianter fra en fælles forfader, f.eks. som fætter og kusine fra en oldefars bedsteforældre. Disse alleler, der kaldes “identisk af afstamning” (IDB), er et effektivt redskab til genopdagelse, hvis de udelukkende optræder hos personer, der har den samme sygdom.
DEN AMISH FORBINDELSE
Den dreng, jeg mødte på klinikken, og 4 af hans 5 søskende har cortical dysplasia-focal epilepsy (CDFE)-syndrom. Det skyldes en enkelt manglende DNA-base i et gen kaldet CNTNAP2.
Som mange historier om genopdagelser begyndte opdagelsen af, at mutationer i CNTNAP2 ligger bag en række hjernetilstande – autisme, kramper, skizofreni, Tourettes syndrom og sprogforstyrrelser – med forskellige tråde. Lad os fokusere på autismeforbindelsen.
Selv de ældste genteknikker viser, at der er en arvelig komponent i autisme. Enæggede tvillinger har langt større sandsynlighed for begge at have det end tveæggede tvillinger; søskende til et barn med autisme har en risiko, der er 75 gange større end i den almindelige befolkning.
I 1998 brugte International Molecular Genetic Study of Autism Consortium GWAS til at identificere 6 regioner i genomet, der fulgte med personer med autisme – den bedste kandidat var på den lange arm af det syvende største kromosom eller “7q.”
I 1999 involverede forskere CASPR2, en type protein kaldet neurexin, der, når det er unormalt, forstyrrer udsendelsen af en nerveimpuls. Neurexinerne er på linje med andre proteiner kaldet neuroliginer for at skabe de synapser, der dannes, når et lille barn begynder at udforske verden og konsoliderer hukommelsen til indlæring.
I 2003 kom rapporter om omarrangerede kromosomer, der forstyrrer det gen, der koder for CASPR2, CNTNAP2, hos personer med Tourettes syndrom og i 2007 hos personer med intellektuel funktionsnedsættelse, udviklingshæmning, nedsat tale og hyperaktivitet, men ikke Tourettes syndrom. Disse forskellige tilstande er ikke overraskende – virkningerne varierer afhængigt af, hvor i hjernen neurexinniveauet er ubalanceret.
I 2006 matchede forskere fra Clinic For Special Children og Translational Genomics Research Institute en mutation i CNTNAP2 med CDFE-syndromet hos nært beslægtede Amish-børn. Anfaldene begynder omkring den alder, hvor autistiske træk har tendens til at dukke op – 14 til 20 måneder.
Hvor anfaldene begynder, er symptomerne på CDFE subtile: mindre motoriske forsinkelser, dårlige dybe senereflekser og lidt for store hoveder. Børnene har svært ved at koncentrere sig, efterligne personer og planlægge bevægelser, f.eks. kravle, krydstogt og gå. Anfaldene er hyppige og alvorlige, og deres indtræden varsler en aftagende udvikling af færdigheder – sproglige, kognitive og sociale færdigheder. Efter flere år ophører anfaldene, men intellektet forbliver i stampe i barndommen, og individet kræver livslang pleje.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, og Holmes Morton, MD, fra klinikken og deres kolleger brugte 100.000-SNP-mikroarray-enheder til at analysere DNA’et fra fire børn med CDFE-syndromet fra tre Amish-familier. De fandt et autozygot område på 7,1 millioner baser på det mistænkte område på 7q. (I dag opdager algoritmer hurtigt autozygositet i exomsekvenser.)
De 7,1 millioner baser omfatter 83 gener, men kun nogle få gav mening. Holdet sekventerede først et gen kaldet CENTG3, der er kendt for at forårsage andre hjernesygdomme. Men de syge børn havde ikke mutationer i det.
Da fandt dr. Puffenberger, genetikeren på holdet, en genvej: Han bemærkede en SNP i midten af CENTG3, som var heterozygot hos to børn (to forskellige varianter) i stedet for homozygot (den samme variant i begge kromosomkopier), hvilket markerede en ende på området med identisk afstamning. “En rekombinationsbegivenhed i midten af genet gjorde det muligt for Eric at komme af med en stor del af det for at finde mutationen. Det er et perfekt eksempel på ’tilfældighederne favoriserer den forberedte hjerne’,” fortalte Dr. Morton mig. Denne opdagelse reducerede det interessante område på 7q til 3,8 millioner baser.
Det andet kandidatgen, CNTNAP2, ligger på tværs af det interessante område. Hvert barn manglede en enkelt base fra begge kopier af kromosom 7 der, og hver forælder havde den samme mutation, men kun i den ene kopi. De er bærere. Det var Mendels første lov på arbejde.
Teamet havde fundet deres gen. Derefter kiggede de videre i samfundet, og blandt 105 raske amish-folk var fire af dem bærere. Ni ud af 18 patienter, der havde delvise anfald, men ingen specifik diagnose, fra 7 familier, havde CDFE-syndromet.
Anfaldene var gådefulde. “En mutation kan forårsage forskellige typer af kramper. Fire børn i en familie reagerer forskelligt. Nogle er meget handicappede, andre er ikke meget påvirket,” sagde Dr. Morton. Tre børn blev opereret for at lindre anfaldene, men lindringen varede ikke ved. Men operationerne gav prøver af hjernevæv, som gjorde det muligt for forskerne at beskrive bedre, hvad der gik galt.
Sammenkoblingen i de anfaldsramte hjerner er et rod. Grænserne mellem grå substans og hvid substans udviskes, og nogle dele af hjernebarken er fortykket. Selve neuronerne er ikke helt rigtige. De er for runde, for tætpakkede og har forstyrrede dendritiske træer. Prikker på neuronerne antyder, at der er for mange kerner fra gliacellerne, de støtteceller, der udgør det meste af nervesystemet. Forskningsrapporten fra 2006 var poetisk og beskrev amygdala, følelsernes sæde, i de epileptiske hjerner som “excentriske mikroskopiske øer af delvist modne neuronale forstadier i tætte klynger” omgivet af glia, der gik amok.
Portrættet af den amske epileptiske hjerne gav mening i lyset af arbejdet med neurexinproteinet CASPR2 (som står for contactin-associeret proteinlignende 2). Neurexin danner et stillads ved Ranvier-knuderne. Knuderne er de udsatte steder på et axon mellem puder af myelin, det isolerende materiale, som i virkeligheden er gliacellernes cellemembraner, der er viklet om neuronen som et plaster om en finger. Nerveimpulserne passerer knuderne og sender meddelelser hurtigt nok til at opretholde livet.
CASPR2-proteinerne hos Amish-børnene er forkrøblede. De krydser ikke neuroncellens membraner og dypper ikke ned i cytoplasmaet, som de burde, og som følge heraf kollapser nærliggende kaliumkanaler. Disse kanaler gør det normalt muligt for kaliumioner at styrte ud af nervecellerne, når en impuls passerer, og nulstiller den. Så uden neurexin-stellet kan neuronet ikke nulstille sig selv. Transmissionen stopper. Og på en eller anden måde begynder kramperne. Jeg tror ikke, at man ved, om kramperne fremkalder de autistiske træk, eller om de opstår direkte – yderligere genetiske undersøgelser skulle vise det.
En musemodel
Daniel Geschwind, læge, ph.d. og professor i neurologi ved David Geffen School of Medicine ved UCLA, arbejdede på autisme-gener og læste artiklen fra 2006 i New England Journal of Medicine. “Han ringede og sagde: “Du har fundet mit gen! Et fint samarbejde begyndte, og han lavede en mus med Amish-mutationen,” siger Dr. Morton. Musene har CNTNAP2-genet slået ud, og ligesom mennesker har de anfald og autistiske træk.
“En mus løber normalt rundt i buret, normalt social og snakkende. Disse mus var ingen af delene,” forklarede Dr. Morton. Musene udviste også gentagende adfærd og havde kramper.
Hjernerne hos de muterede mus viste et unormalt forbindelsesmønster, der mindede om det tidligere histologiske arbejde. “Den forreste del af hjernen taler mest med sig selv. Den kommunikerer ikke så meget med andre dele af hjernen og mangler langtrækkende forbindelser til den bageste del af hjernen,” sagde Dr. Geschwind. Gruppen havde vist lignende abnormiteter i hjernen hos børn med autisme.
Den slående lighed mellem amish-børnene og musene giver et testområde for lægemidler. Risperidon, der er ordineret til behandling af gentagende adfærd hos børn, havde den samme effekt på musene og forbedrede samtidig deres evne til at bygge reder. Men stoffet hjælper ikke børnene med at socialisere.
Et oplagt kandidatstof til at forbedre de sociale færdigheder er “kærlighedshormonet” oxytocin. Det er rigeligt til stede i de samme hjerne-neuroner, som er rige på CASPR2-protein. Kunne for lidt oxytocin forårsage autistiske træk? Resultaterne af tilskud af oxytocin er lovende, både hos mus og børn.
Dr. Geschwind og medarbejdere fandt, at en næsespray af oxytocin “dramatisk forbedrer de sociale underskud” hos musene. Da ikke-autistiske mus ikke reagerede, synes hormonet faktisk at kompensere for et underskud.
Amish-bønder giver allerede oxytocin til køer for at trække deres livmodermuskler sammen, og jeg kan huske, at jeg fik det for at sætte gang i en gået i fødslen. Men lad være med at prøve det derhjemme. Der er flere kliniske forsøg i gang med oxytocin eller lægemidler, der øger dets aktivitet i hjernen for at forbedre socialiseringen hos børn med autisme.
Autism Speaks finansierede det første kliniske forsøg med oxytocin i 2010, og NIH sponsorerer et større igangværende forsøg med oxytocin-næsespray. Men så vidt jeg kan se, blev patienterne indskrevet på baggrund af kliniske diagnoser i henhold til DSM-IV – ikke det mere specifikke kriterium om genotype.
Men selv om idéen om at prøve oxytocin for at forbedre sociale symptomer ved autisme ikke krævede kendskab til den underliggende mutation, kan sådanne oplysninger tilføje præcision til eventuelle konklusioner ved at overveje mekanismen – hvilket kan føre til udvikling af andre behandlinger. I et andet indlæg vil jeg se på, hvordan genetisk præcision gjorde det muligt for Dr. Morton at udvikle behandlinger for visse medfødte stofskiftefejl, som er langt mere almindelige blandt amish-indianerne, men som stadig dukker op på nyfødte screeninger hos alle.