Albers-Schönbergs sygdom (autosomal dominant osteopetrose, type II) skyldes mutationer i ClCN7-kloridkanalgenet

Abstract

Albers-Schönbergs sygdom, eller autosomal dominant osteopetrose, type II (ADO II), er den mest almindelige form for osteopetrose, en gruppe af tilstande, der er karakteriseret ved en øget skeletmasse på grund af nedsat knogle- og bruskresorption. Efter tilknytningen af det gen, der forårsager ADO II, til kromosom 16p13.3, rapporterer vi nu syv forskellige mutationer i det gen, der koder for ClCN7-kloridkanalen, i alle 12 analyserede ADO II-familier. Desuden blev en patient med den alvorlige, autosomalt recessive, infantile form af osteopetrose (ARO) identificeret som værende homozygot for en ClCN7-mutation. Ud fra genotype-fænotype korrelationer ser det ud til, at ADO II afspejler en dominerende negativ effekt, mens tab af funktionsmutationer i ClCN7 ikke forårsager abnormiteter hos heterozygote individer. Da nogle ARO-patienter har mutationer i begge kopier af ClCN7-genet, er ADO II allelisk med en delmængde af ARO-tilfælde.

Receptioneret 2. oktober 2001; Revideret og accepteret 11. oktober 2001.

INTRODUKTION

I sundhed er knoglevævets remodellering et resultat af de afbalancerede processer med knogledannelse og -resorption. Overdreven resorption forårsager osteoporose, som er årsag til de fleste ikke-traumatiske frakturer (1). Omvendt forårsager defekt knogleresorption osteopetrose, der er karakteriseret ved tætte, men normalt skrøbelige knogler. Der er beskrevet mindst otte typer af osteopetrose hos mennesker (2). Mangel på isoenzymet carbonic anhydrase II forårsager autosomal recessiv osteopetrose (ARO) med renal tubulær acidose og cerebrale forkalkninger (3; MIM 259730), mens størstedelen af tilfældene af malign ARO (4; MIM 259700) afspejler mutationer i TCIRG1-genet (5,6). Nogle sjældne tilfælde af osteopetrose, der tilsyneladende har en autosomal recessiv arveform, har en mildere fænotype og kaldes derfor den “intermediære” form (7,8; MIM 259710).

Autosomal dominant osteopetrose (ADO) er langt mere almindelig end dens recessive modstykker (9). På grund af det relativt godartede kliniske billede, hvor mange patienter er asymptomatiske og kun opdages ved tilfældig radiografisk undersøgelse, undervurderes prævalensen af ADO imidlertid. Blandt familier med ADO rapporteres der generelt om to undertyper, der primært er baseret på radiografiske træk (10,11). Type I (ADOI) er kendetegnet ved en generaliseret, diffus osteosklerose, der især påvirker kraniehvælvingen (11). Type II (ADO II; MIM 166600), den form, der oprindeligt blev beskrevet i 1904 af Albers-Schönberg (12), er den mest almindelige form med en anslået prævalens på op til 5,5/100 000 (13). De kliniske manifestationer omfatter ikke-traumatiske frakturer, især af de lange knogler, kranienervelammelser, slidgigt i hoften og osteomyelitis i underkæben (14). ADO II manifesterer sig radiografisk med en segmentær osteosklerose, overvejende ved de vertebrale endeplader (“rugger jersey spine”), iliac wings (“bone within bone”-tegn) og kraniebasis (9) (Fig. 1) (9) (Fig. 1).

For nylig førte en genom-dækkende søgning til, at vi tildelte et gen, der ligger til grund for ADO II, til kromosom 16p13.3 (15). Interessant nok ligger genet, der koder for kloridkanalen ClCN7, inden for kandidatområdet på 8,4 cM (16). Kloridkanalen er faktisk afgørende for forsuring af den ekstracellulære resorptionslakuna, der er nødvendig for den osteoklastmedierede nedbrydning af knoglevæv (17), og den er muteret hos en patient med ARO (17). Derfor betragtede vi ClCN7 både som et positionelt og funktionelt kandidatgen for at forårsage Albers-Schönberg-sygdom.

RESULTATER

Mutationsanalyse af ADO II-familier

Da den genomiske sekvens, herunder ClCN7-genet, er tilgængelig fra sekvensdatabaser (GenBank accession nos AL031600 og AL031705), er det muligt at foretage mutationsanalyse af exonerne og intron-exon-grænserne ved hjælp af genomisk DNA. Denne indsats afslørede syv karakteristiske mutationer i ClCN7 (fig. 2) i 12 ikke-sammenhængende ADO II-familier (tabel 1). Fem mutationer er missense, én resulterer i en sletning af én aminosyre, og én sletter to nukleotider og forårsager et frameshift, der påvirker proteinets C-terminale ende. Ingen af disse mutationer blev fundet i 100 kontrolkromosomer.

Fire mutationer er redundante mutationer. 2423delAG-mutationen blev identificeret i en familie fra Frankrig og i en amerikansk familie. G215R-mutationen forekom i en fransk, en dansk og en amerikansk familie. P249L-mutationen blev fundet i en fransk og i en tysk familie. Endelig blev R767W-mutationen identificeret i en fransk og en amerikansk familie (tabel 1). De undersøgte familiers forskellige geografiske oprindelse samt analysen af mikrosatellitmarkører, der flankerer ClCN7-genet (data ikke vist), tyder på, at der er tale om uafhængige mutationer, dvs. at de ikke er nedarvet fra en fælles forfader.

Mutationsanalyse af en ARO-patient

Linkageanalyse med markører fra kromosom 16p13.3 viste klart homozygotitet for alle markører hos en ARO-patient født af consanguinerede, raske forældre (data ikke vist). Derfor blev der udført en mutationsanalyse af ClCN7, som viste en homozygot missense-mutation ved position 766 (L766P) (Fig. 2). Begge forældre er heterozygote for denne mutation.

Position og bevarelse af muterede aminosyrer

Den transmembrantopologi, der er foreslået for ClC-kloridkanalerne, tyder på 10-12 transmembrandomæner (18). De fem aminosyrer, der er involveret i de missense ADO II-mutationer, såvel som den mutation, der er involveret i ARO-patienten, er alle stærkt konserverede blandt de forskellige medlemmer af ClC-kloridkanalgenfamilien (Fig. 3). G215R- og P249L-mutationerne er tilbagevendende mutationer, der er fundet hos patienterne i henholdsvis tre og to ubeslægtede familier (tabel 1). G215 er en meget bevaret rest, der er placeret mellem D2 og D3 (Fig. 4), et område, som er kendt for at påvirke kanalernes poregenskaber (19), mens P249 indgår i et meget bevaret, strukturelt element, der udgør en væsentlig del af ClC-kanalens pore (20). R286 er placeret i det ekstracellulære rum, lige uden for transmembrandomænet D5. Denne aminosyre er bevaret blandt de forskellige ClC-proteiner, med undtagelse af ClC1 og ClC2, som har en divergerende sekvens i dette område af proteinet. De to resterende ADO II-mutationer og ARO-mutationen befinder sig i den cytosoliske, C-terminale del af proteinet og involverer tilstødende aminosyrer. G765, L766 og R767 er placeret inden for D13-strækningen, som falder sammen med det andet CBS-domæne (cystathionin-β-syntase), der er beskrevet i CLCN7-proteinet (21). Alle tre mutationer lokaliseres inden for β2-strengen af CBS-domænet, hvor mutationer er blevet rapporteret til at forårsage sygdom hos mennesker (22). Den præcise funktion af dette domæne er stadig uklar, men der er blevet foreslået en rolle i proteinsortering (21).

Endelig involverer de to små deletioner aminosyrer fra den intracellulære C-terminale del af ClCN7. Aminosyren L688, der er slettet hos en patient, er placeret mellem de to CBS-domæner, mens deletionen af to nukleotider fra nukleotidposition 2423 hos to ikke-relaterede familier resulterer i et protein, der kun adskiller sig fra wild-type ClCN7 i de sidste 10 aminosyrer.

DISCUSSION

Osteopetroser hos pattedyr omfatter en heterogen gruppe af tilstande, herunder mindst otte forskellige kliniske enheder hos mennesker (2) og omkring ni spontane mutanter hos dyr (23). Desuden forårsager knockout musemodeller for flere gener osteopetrotiske fænotyper, hvilket illustrerer mangfoldigheden af faktorer, der er involveret i osteoklastdifferentiering og -aktivering (23).

For nylig blev heterogeniteten for humane osteopetroser understreget af genetisk heterogenitet selv inden for ADO II-subtypen (24,25). Denne afsløring var baseret på en linkageundersøgelse, der omfattede en udvidet dansk familie, som tilknyttede ADO II-genet til kromosom 1p21 (26). Denne tilknytning blev imidlertid ikke bekræftet i undersøgelser af andre ADO II-familier. I vores nylige koblingsundersøgelse, der omfattede seks ADO II-familier, lokaliserede vi faktisk det sygdomsfremkaldende gen på kromosom 16p13.3 og fandt i den samme danske familie samregulering mellem ADO II og en haplotype på kromosom 16p13.3 (15). Derfor spekulerede vi, at beviset for linkage til kromosom 1p21 i denne familie afspejlede tilfældig cosegregation. I denne aktuelle undersøgelse bekræftede vi denne hypotese ved at identificere en sygdomsforårsagende mutation (G215R) i ClCN7-genet i denne danske familie. Dette og det faktum, at mutationer i dette gen blev fundet i alle 12 analyserede ADO II-familier, tyder på, at ADO II er genetisk homogen.

Vores resultater illustrerer også, at ADO II er allelisk med en undergruppe af patienter med den alvorlige, autosomalt recessive, infantile form af osteopetrose. Tidligere er en ARO-patient blevet beskrevet som en sammensat heterozygot for en nonsense-mutation (Q555X) og en missense-mutation (R762Q) i ClCN7-genet (17). Vi finder nu en homozygot mutation (L766P) hos en anden ARO-patient.

Figur 5 illustrerer vores korrelation mellem de forskellige genotyper og fænotyper. Som det fremgår af fænotypen af ClC-7 knockout musen, forårsager fuldstændigt tab af funktionen af ClC-7 kloridkanalen alvorlig osteopetrose, som det ses hos ARO patienter. Da ClCN7-mutationer kun er blevet karakteriseret hos to ARO-patienter til dato, er det umuligt at vide, om eventuelle fænotypiske forskelle afspejler arten af deres mutationer. Nogle sjældne tilfælde af osteopetrose har en “intermediær” form. I disse tilfælde foreslås en autosomal recessiv arveform, men fænotypen er mildere end i ARO (7,8). Måske skyldes disse tilfælde kombinationer af to mutationer i ClCN7, der hver især kun reducerer kapaciteten for Cl-ledningsevne i mild grad.

De ADO II-mutationer, der er rapporteret her, er primært missense-mutationer, der involverer konserverede aminosyrer (fig. 3 og 4). De to resterende mutationer er små deletioner, der også bevarer kloridkanalens hovedanatomi, og som derfor højst sandsynligt resulterer i virkninger, der er sammenlignelige med missense-mutationerne. Da kloridkanaler synes at være organiseret som multimere, sandsynligvis dimere (27), forringer disse mutationer sandsynligvis deres funktion på grund af dominerende negative virkninger. Med sådanne virkninger vil de fleste kloridkanaler ikke fungere, hvilket forklarer de fænotypiske abnormiteter.

Generelt er forældrene til ARO-patienter fænotypisk normale. Vi antager, at dette afspejler det faktum, at haploinsufficiens for dette gen højst sandsynligt ikke forårsager kliniske komplikationer eller radiografiske fund. Alternativt kan dette i nogle tilfælde skyldes den reducerede penetrering af ADO II. Forældrene til den ARO-patient, der præsenteres i denne undersøgelse, har ingen kliniske symptomer på ADO II, men en radiografisk undersøgelse var ikke tilgængelig.

Den alleliske karakter af ADO II og ARO understøttes i en rapport om en storfamilie med segregering af ADO II, hvor et individ manifesterede ARO (28). Måske er det i denne familie et muteret ClCN7-gen med en dominerende negativ effekt, der forårsager ADO II, som derefter falder sammen med en de novo-mutation eller en mutation, der er nedarvet fra den anden forælder, og som forårsager ARO. Den foreslåede forklaring på både dominerende og recessive former for osteopetrose, der er forbundet med ClCN7-mutationer, er parallel til mutationer i ClC-1-genet, der forårsager myotoni. Mutationer, der medfører tab af ClC-1, forårsager den autosomale, recessive form (Becker-typen) (29), mens missense-mutationer giver den mindre alvorlige, autosomalt dominerende form (Thomsen-typen) (30).

Sammenfattende viser vi, at de fleste, om ikke alle, tilfælde af ADO II skyldes mutationer i ClCN7-genet. Baseret på arten af ClCN7-mutationerne skyldes ADO II-fænotypen sandsynligvis en dominerende negativ effekt. Vores resultater understøtter hypotesen om, at kloridkanaler generelt fungerer som homomultimere. Desuden illustrerer vores undersøgelse den alleliske karakter af ADO II og en delmængde af ARO-tilfælde.

MATERIALER OG METODER

Familier og patienter

Familier A-F blev tidligere beskrevet, da de blev brugt til at lokalisere Albers-Schönberg-sygdomsgenet på kromosom 16p13.3 (15). Prøverne G-L er fra berørte personer fra familier med en historie af Albers-Schönbergs sygdom, og flere er også blevet beskrevet (31-33) (tabel 1).

Familie M bor i USA, men er af kinesisk afstamning. Proposita er barn af et sundt par og blev født efter en fuld graviditet. Forældrene er kusiner på anden hånd. ARO blev diagnosticeret i en alder af 3 måneder, da hun blev præsenteret på New York Hospital Medical Center of Queens med Bell’s palsy. Radiografisk skeletundersøgelse afslørede alvorlig osteopetrose og flere ikke forskudte skråfrakturer. Hun havde anæmi, retikulocytose, hepatosplenomegali og let optisk nerveatrofi. Barnet gennemgik en fejlmatchet allogen marvtransplantation, men døde i en alder af 18 måneder af sepsis og respirationssvigt.

Mutationsanalyse

DNA blev isoleret fra blod efter standardprocedurer. Intron-primere (tabel 2), der amplificerer alle kodende exoner og intron-exon-grænser af ClCN7, blev designet ud fra genomiske sekvenser (GenBank accession nos AL031600 og AL031705). De 25 exoner blev amplificeret fra genomisk DNA Taq-polymerase eller med PCR enhancer system (Gibco BRL) med enhancerkoncentration 1×. For alle amplifikationer blev der udført 30 cyklusser ved en temperatur, der er angivet i tabel 2.

PCR-produkterne blev renset med Concert Rapid PCR-rensningssystemet (Life Technologies) og direkte sekventeret med de primere, der blev anvendt til amplifikationen, ved hjælp af Big-Dye terminator-kemi (Perkin-Elmer) på en ABI 3100 automatiseret sekvenseringsmaskine. Amplifikation af exon 9 resulterede i et fragment af variabel længde, fordi dette exon følger en tandem gentagelse af en sekvens på 50 bp med variabelt antal kopier. I vores sæt af prøver varierede antallet af kopier mellem fire og syv gentagelser. Denne gentagelse forstyrrer også i nogle prøver sekventeringen af dette exon i fremadgående retning.

Alle exoner, hvor der blev påvist formodede mutationer, blev sekventeret i 100 kontrolkromosomer uden at finde mutationerne.

AKKEHISTORIER

Vi takker patienterne og familierne samt de klinikere, der har stillet materiale til rådighed. Denne forskning blev støttet af en bevilling (G.0404.00) fra “Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) til W.V.H. Denne forskning blev også støttet af bevillinger fra “Société Française de Rhumatologie” (SFR), “Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) og Shriners Hospital for Children (nr. 8540).