Adenosine deaminase (ADA) er et nøgleenzym i purin salvage pathways og mangel forårsaget af mutationer i ADA-genet resulterer i en af de mere almindelige årsager til autosomal recessiv svær kombineret immundefekt (SCID), der tegner sig for ca. 10-15% af tilfældene i outbred populationer . Manglende eller nedsat ADA-funktion fører til ophobning af de toksiske metabolitter adenosin, 2’deoxyadenosin og deoxyadenosintrifosfat (dATP). ADA-deficient SCID er karakteriseret ved alvorlig lymfocytopæni, der påvirker T- og B-lymfocytter og NK-celler, men på grund af enzymets allestedsnærværende karakter observeres også ikke-immunologiske manifestationer, herunder neuroudviklingsmæssige underskud, sensorineural døvhed og skeletanomalier. Forekomsten af ADA-mangel i Europa anslås at være mellem 1:375 000 og 1:660 000 levende fødsler . Tidlig diagnosticering af ADA-deficient SCID og iværksættelse af behandling er afgørende for denne ellers dødelige tilstand. De nuværende behandlingsmuligheder omfatter enzymerstatningsterapi (ERT), allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) og autolog genterapi (GT).
Biokemi
ADA er et ubiquitært udtrykt metabolisk enzym, selv om niveauet af enzymaktivitet varierer, med de højeste niveauer observeret i lymfoide væv, især i thymus, hjernen og mave-tarmkanalen , og udtrykkes både intracellulært og på celleoverfladen komplekseret med CD26 . Sammen med purinnukleosidphosphorylase udgør den en væsentlig komponent i purin-balancen, der er ansvarlig for den irreversible deaminering af adenosin og 2’deoxyadenosin til henholdsvis inosin og 2’deoxyinosin. Manglende eller nedsat funktion resulterer derfor i både intracellulær og ekstracellulær ophobning af disse substrater. Adenosin stammer primært fra nedbrydning af adenosintrifosfat (ATP) og RNA, og 2’deoxyadenosin stammer fra nedbrydning af DNA. 2’deoxyadenosin hæmmer irreversibelt enzymet S-adenosylhomocystein (SAH)-hydrolase, hvilket medfører ophobning af SAH, som efterfølgende forhindrer S-adenosylmethionin-medierede methyleringsprocesser, der er nødvendige for normal thymocytdifferentiering, hvilket sandsynligvis bidrager til den forringelse af T-lymfocytudviklingen, der er tydelig ved ADA-mangel . Øget intracellulær optagelse af 2’deoxyadenosin efterfulgt af fosforylering af deoxycytidinkinase fører til akkumulering af deoxyadenosintrifosfat (dATP), som hæmmer ribonukleotidreduktase, hvilket forhindrer normal DNA-syntese og reparation . Adenosin er et vigtigt ekstracellulært signalmolekyle; forstyrrelser af disse signalveje menes at kunne forstyrre normale immunreaktioner . Adenosinreceptorer tilhører familien af G-protein-koblede receptorer, hvoraf der findes fire undertyper (A1, A2A, A2B og A3), som spiller forskellige roller i reguleringen af normal cellulær fysiologi i en lang række væv, herunder hjernen, det kardiovaskulære system og lungerne .
Diagnose
Diagnosen ADA-mangel er fastlagt ved biokemisk og molekylærgenetisk testning. Biokemisk test viser manglende eller stærkt nedsat ADA-aktivitet (< 1 % af normalen) og markant forhøjelse af metabolitten dATP eller de samlede dAdo-nukleotider (summen af dAMP, dADP og dATP) i erytrocytter. En nedsat aktivitet af SAH-hydrolase i erytrocytterne (< 5 % af normalen) er også karakteristisk . Hvis en patient med formodet ADA-mangel for nylig har fået en blodtransfusion, kan analysen af ADA-aktivitet måles hos forældrene, idet der ses nedsat aktivitet hos heterozygote bærere, eller den kan udføres på ikke-erytroide celler som f.eks. leukocytter. Fibroblaster kan også anvendes, men fibroblastkulturer er normalt ikke let tilgængelige, og dette kan forsinke diagnosen. Molekylærgenetisk diagnose bygger på identifikation af bi-alleliske patogene mutationer i ADA-genet, der er placeret på kromosom 20q12-q13.11, og hvor der er identificeret over 70 forårsagende mutationer.
Supportive laboratoriefund omfatter lymfocytopæni med fravær af T- og B-lymfocytter og NK-celler og lave serumimmunoglobuliner, selv om IgG i den tidlige barndom kan være normal på grund af materno-placental overførsel. T-lymfocytternes proliferative respons er lavt eller fraværende, og det samme gælder specifikke antistofresponser. Niveauet af metaboliske substrater og genotypen har vist sig at korrelere med sværhedsgraden af den kliniske fænotype .
Kliniske manifestationer
Immunsystem – virkninger på cellulært niveau
De dominerende konsekvenser af ADA-mangel er på immunsystemet og forårsager alvorlig udtømning af T- og B-lymfocytter og NK-celler, hvilket resulterer i nedsat cellulær og humoral immunitet. Høje niveauer af ADA udtrykkes i lymfoide væv på grund af de høje niveauer af celleomsætning, især i thymus, hvilket sandsynligvis forklarer de resulterende alvorlige lymfocytotoksiske virkninger af mangel . De underliggende mekanismer, der er ansvarlige for de skadelige virkninger på immunsystemet, er blevet belyst ved hjælp af eksperimentelle modeller med ADA-mangel. Der er udprægede virkninger på thymocytudviklingen, selv om det præcise stadium, hvor dette sker, er ukendt. Apasov et al. påviste omfattende apoptose i thymi i ADA(-/-)-murinmodeller, men ikke i de perifere lymfeknuder og milt, hvilket viser den skadelige virkning på thymocytter under udvikling. Apoptose i thymierne var tydelig overvejende ved den kortiko-medullære overgang og berørte især dobbeltpositive thymocytter. Perifere T-lymfocytter var også unormale med afvigende fordeling i sekundære lymfoide væv og ekspression af cellemarkører samt defekt T-lymfocyt-signalering gennem TCR . Det antages, at kombinationen af både intracellulær ophobning af toksiske substrater og defekt T-lymfocyt-signalering bidrager til udtynding af thymocytter under udvikling.
B-lymfocytkompartmentet påvirkes også ved ADA-mangel, idet patienterne udviser alvorlig B-lymfocytopæni og hypogammaglobulinæmi, selv om den tidlige B-lymfocytudvikling i modsætning til T-lymfocytter ikke synes at være forstyrret i modsætning til T-lymfocytter . Der observeres en unormal arkitektur i splenisk germinalcenter, hvilket tyder på en forringet antigenafhængig B-lymfocytmodning, og B-lymfocytter udviste også nedsat proliferativ evne, øget apoptose og forringet signalering ved aktivering . Dette tyder på, at B-lymfocytdefekten sandsynligvis snarere er relateret til nedsat differentiering på grund af en intrinsisk defekt end udelukkende på grund af mangel på passende CD4+ T-lymfocythjælp. Forringet V(D)J-rekombination på grund af forhøjede dATP-niveauer kan også påvirke B-lymfocytdiversiteten og -funktionen negativt .
Immunsystem – kliniske manifestationer
Som følge af alvorligt defekt cellulær og humoral immunitet forekommer den typiske præsentation af ADA-mangel tidligt i livet med alvorlige infektioner og manglende trivsel, og berørte individer vil normalt bukke under inden for det første eller andet leveår uden intervention. Det kliniske billede af ADA-deficient SCID ligner andre genetiske former for SCID med vedvarende diarré, dermatitis og alvorlige infektioner, ofte forårsaget af opportunistiske patogener såsom Pneumocystis jiroveci, som er karakteristiske. Fysiske fund omfatter fraværende thymuskirtel på thoraxradiografier og fravær af lymfoide væv.
Non-immunologiske manifestationer
Den allestedsnærværende karakter af ADA betyder også, at konsekvenserne af mangel ikke er begrænset til lymfocytter, og der observeres også mange andre systemiske ikke-immunologiske træk, med kendt indvirkning på nervesystemet, hørelsen, skelettet, lungesystemet, lever- og nyresystemet samt kognitive og adfærdsmæssige abnormiteter. Ikke-immunologiske manifestationer er blevet mere tydelige i de seneste år, efterhånden som overlevelsen og immunrekonstitutionen forbedres efter stamcelletransplantation, og bevidsthed om og identifikation af involvering af flere organsystemer er afgørende for at muliggøre rettidig optimal behandling.
Børn med ADA-mangel har vist sig at udvise en række adfærdsmæssige abnormiteter, herunder opmærksomhedsunderskud, hyperaktivitet, aggression og sociale problemer, som synes at udvikle sig uafhængigt af de påvirkninger, der er forbundet med HSCT . IQ-niveauet er lavere hos børn med ADA-deficient SCID sammenlignet med befolkningsgennemsnittet og sammenlignet med børn med andre former for SCID . Høje niveauer af ADA-ekspression fundet i hjernen , og konstateringen af, at de samlede IQ-scorer korrelerer med niveauet af dATP ved diagnosen , understøtter yderligere teorien om, at kognitiv svækkelse både er en konsekvens af den metaboliske forstyrrelse i ADA-mangel og afhængig af graden af mangel.
Bilateralt sensorineuralt høretab blev først rapporteret hos to patienter med ADA-mangel, som var blevet succesfuldt behandlet med HSCT. Strukturelle og infektiøse årsager blev udelukket, og begge patienter modtog ikke nogen konditionering før HSCT, hvilket udelukker dette som en potentiel årsag og implicerer den underliggende metaboliske defekt . Der blev rapporteret om en høj prævalens af bilateralt sensorineuralt høretab (58 %) i en kohorte på 12 patienter med ADA-mangel, som var blevet behandlet med HSCT . I denne undersøgelse blev der ikke fundet nogen sammenhæng mellem døvhed og dATP-niveauer.
Adenosindeaminases metaboliske rolle og konsekvenserne af ophobning af toksisk substrat i lungerne er blevet påvist i eksperimentelle modeller, hvor ADA(-/-)mus viser alvorlig lungeinflammation med ophobning af aktiverede makrofager og eosinofile og remodellering af luftvejene, der er reversibel ved iværksættelse af ERT . Musemodeller har også vist, at langvarig eksponering for høje koncentrationer af adenosin i lungerne som følge af behandling med lav dosis ERT fører til udvikling af lungefibrose, men disse ændringer blev vendt ved reduktion af de pulmonale adenosinniveauer . Hos ADA-deficiente patienter ses lignende lungemanifestationer, og ikke-infektiøs lungesygdom, herunder pneumonitis og pulmonal alveolær proteinosis (PAP), forekommer hyppigere end i andre genetiske former for SCID . 43,8 % af patienterne med ADA-deficient SCID havde PAP i en undersøgelse, som hurtigt forsvandt (hos alle undtagen én patient) efter påbegyndelse af ERT .
Skeletale abnormiteter, som f.eks. involverer de costochondrale led, er almindeligt rapporteret, muligvis relateret til en ubalance mellem nuclear factor-κB ligand (RANKL) og osteoprotegerin (OPG), der forstyrrer interaktionen mellem osteoblaster og osteoklaster og den efterfølgende knogledannelse, selv om abnormiteterne hovedsagelig kun er synlige på radiologisk billeddannelse uden dysmorfiske konsekvenser . Effekten af toksiske metabolitter på knoglemarven kan spille en rolle i den “auto-konditionering”, der er tydelig i ADA-deficient SCID, med skabelse af stamcelle-nicher, der letter donors hæmatopoietiske stamcelletransplantation. Der er imidlertid også rapporteret om skeletafvigelser i andre immundefekter, og der ses ikke fuldstændig korrektion efter behandling, hvilket tyder på andre faktorer, der er involveret i patogenesen.
Hepatisk involvering i ADA-defekt synes at være forskellig mellem mus og mennesker. Murine ADA(-/-)-modeller viser alvorlig hepatocellulær degeneration, som er dødelig i den perinatale periode . Til sammenligning ses der normalt ikke en alvorlig grad af leverforstyrrelser hos ADA-deficiente patienter, selv om der er en rapport om en patient med ADA-deficient SCID, der udviklede hurtigt dødeligt leversvigt, som ikke kunne tilskrives infektion , og et nyfødt barn med ADA-deficient SCID med hepatitis og hyperbilirubinæmi, som blev løst med ERT . Rapporter om nyrepåvirkning ved ADA-mangel omfatter forekomst af mesangial sclerose, der blev fundet i 7/8 obduktioner af ADA-mangelfulde patienter, hvor 6/8 også udviste kortikal sclerose af binyrerne . Der blev rapporteret om atypisk hæmolytisk uræmisk syndrom hos 4 patienter med ADA-mangel, hvoraf 2 blev helbredt med let eller ingen resterende nyreforstyrrelser efter understøttende behandling og iværksættelse af ERT . Dermatofibrosarcoma protuberans er en sjælden malign hudtumor, som er blevet rapporteret at forekomme hyppigere hos patienter med ADA-mangel, men mekanismen bag dette er uklar .
Mens ADA-mangel er bredt accepteret som en systemisk metabolisk lidelse, er det vigtigt at overveje, at visse systemiske manifestationer kun er blevet rapporteret hos et lille antal patienter. Andre medvirkende faktorer som f.eks. infektiøse agenser kan være involveret, og der er behov for yderligere undersøgelser af den underliggende patogenese for disse manifestationer. Ikke desto mindre er bevidsthed om multiorganinvolvering afgørende for optimal patientpleje.
Partiel og sent indsættende ADA-mangel
Der er heterogenitet i fænotypen af ADA-mangel, idet ca. 15-20 % af patienterne udviser et “forsinket klinisk indsæt”, der præsenteres med mindre alvorlig, men gradvist forværrende, kombineret immundefekt senere i livet, normalt inden for det første årti, men lejlighedsvis i voksenalderen . De kliniske manifestationer i denne gruppe med “forsinket debut” omfatter tilbagevendende, men mindre alvorlige infektioner, der især rammer sinopulmonale trakter. Der forekommer også virusinfektioner med papillomavirus . Autoimmunitet, allergi og forhøjede IgE-niveauer kan også forekomme . På grund af dette spektrum af kliniske fænotyper er det vigtigt at overveje at stille diagnosen ADA-mangel hos ældre personer, da forsinket erkendelse fører til forringelse af den immunologiske funktion og udvikling af irreversible følgesygdomme af tilbagevendende og kroniske infektioner. Screening har også identificeret asymptomatiske personer, som har meget lav eller ingen ADA-aktivitet i erytrocytter, men større ADA-aktivitet (2-50 % af normalen) i cellekerneceller, såkaldt “delvis ADA-mangel” . Disse patienter har tilsyneladende normal immunfunktion og forventet levetid, selv om der i øjeblikket ikke foreligger data fra langtidsopfølgning, der kan bekræfte dette.
Behandling
I modsætning til andre former for SCID omfatter behandlingen af ADA-mangel flere muligheder; ERT, allogen HSCT og autolog GT, hvoraf kun de to sidstnævnte er kurative.
ERT med polyethylenglycol-konjugeret adenosindeaminase (PEG-ADA) er den eneste terapeutiske mulighed, som ikke er definitiv med hensyn til sygdomskorrektion, men som giver mulighed for systemisk clearance eller “afgiftning” af de toksiske metaboliske substrater. ERT er en mulighed, hvis der ikke findes en egnet HSCT-donor, eller hvis der er kontraindikationer for HSCT, men langvarig ERT er dog forbundet med suboptimal immunrekonstitution . Andre begrænsninger ved ERT omfatter manglende tilgængelighed i nogle lande, høje omkostninger og det faktum, at der kræves livslang behandling. Det er også en kortsigtet mulighed, der anvendes som en stabiliserende bro til HSCT eller GT for at forbedre den endogene immunfunktion og hjælpe med at komme sig efter infektioner eller i forbindelse med pulmonal alveolær proteinose for at optimere den kliniske tilstand forud for endelig behandling . Brugen af ERT og tidspunktet for ophør forud for allogen HSCT skal overvejes nøje, da en forbedring af modtagerens immunitet udgør en potentielt øget risiko for afstødning af transplantatet, men ophør af ERT udsætter patienten for en betydeligt øget risiko for infektion. Interessant nok viste Hassan et al. ingen forskel i overlevelsesresultatet mellem patienter, der fik og ikke fik ERT ≥ 3 måneder før HSCT, men størstedelen af den gruppe, der fik ERT, fortsatte med at få matchede ubeslægtede donorer/mismatchede ubeslægtede donorer (MUD/MMUD) eller haploidentiske donortransplantationer . ERT kan fortsættes i en måned efter GT eller indtil infusionen for at opretholde et lavt niveau af toksiske metabolitter for at lette indpodningen af de genkorrigerede celler .
Traditionelt har HSCT været den foretrukne behandling af ADA-deficient SCID, som normalt udføres så hurtigt som muligt efter diagnosen for at minimere den tid, hvor man udsættes for høje niveauer af toksiske metabolitter og før erhvervelse af infektioner. I den hidtil største undersøgelse, der har undersøgt resultatet af 106 patienter med ADA-deficient SCID efter HSCT, var tidligere HSCT forbundet med en bedre samlet overlevelse, men dette nåede ikke statistisk signifikans, muligvis på grund af et mindre antal patienter i de ældre grupper . Der er observeret et bedre samlet resultat efter HSCT med matchede søskende- og familiedonorer (MSD/MFD) sammenlignet med MUD- og haploidentiske donorer (henholdsvis 86 % og 81 % mod 66 % og 43 %) . Dette kan være relateret til hurtigere adgang til søskende- eller familiedonorer, hvilket sandsynligvis resulterer i en bedre klinisk tilstand ved HSCT. MSD- og MFD-HSCT’er udføres normalt også uden seroterapi, hvilket har en positiv indvirkning på T-lymfocytgenoprettelsesgraden og elimineringen af virusinfektioner hos disse patienter. Resultatet er også betydeligt bedre ved ikke-konditioneret HSCT sammenlignet med myeloablativ konditionering, selv om manglende konditionering også kan forringe engraftingen, især med haploidentiske donorer . Ukonditioneret HSCT med MSD eller MFD er forbundet med vellykket cellulær og humoral immunrekonstitution, selv om det langsigtede resultat af immunstatus er ukendt, og yderligere opfølgning er nødvendig . Dette er i modstrid med andre former for SCID, og det kan være, at de lokale toksiske virkninger af ADA-mangel på knoglemarven fungerer som “auto-konditionering” og muliggør donorstamcelletransplantation i fravær af kemoterapi. Patienter, der overlever HSCT, synes at klare sig godt med hensyn til immunrekonstitution, uanset hvilken donortype der blev anvendt, idet de fleste patienter opnår fuldstændig cellulær og humoral genopretning, er i stand til at give vaccinesvar og ikke har brug for immunglobulinerstatning . I modsætning hertil er kun ca. 50 % af patienterne på langvarig ERT i stand til at ophøre med immunglobulinsubstitutionsbehandling.
Mindre end 25 % af patienterne med ADA-deficient SCID har en MSD eller MFD til rådighed, og i sådanne situationer er GT blevet etableret som en accepteret terapeutisk mulighed. Efter den indledende udvikling for mere end 20 år siden er GT til ADA-deficient SCID blevet en milepæl i den medicinske udvikling som den første ex vivo stamcelle retrovirale vektor GT (Strimvelis™) med EU-licens fra Den Europæiske Union (EU) . Før udviklingen af Strimvelis™ blev der i de første tilgange anvendt knoglemarv eller navlestrengsblod uden forberedende konditionering, men dette resulterede i utilstrækkelig ADA-produktion, og patienterne krævede løbende ERT. Forbedring af genoverførselsmetoderne og indførelse af ikke-myeloablativ konditionering med lav dosis busulfan før infusionen for at skabe plads til de transficerede celler resulterede i en effektiv immunkonstitution og til dato ingen rapporter om genotoksisk insertionsmutagenese , i modsætning til andre primære immundefekter, der behandles med genterapi ved hjælp af retrovirale vektorer . Den hidtil største rapport af Cicalese et al. om 18 ADA-SCID-patienter behandlet med GT, med en medianopfølgning på 6,9 år, rapporterede 100% overlevelse uden leukæmiske transformationer, reduceret infektionsrate og robust T-lymfocyt- og senere B-lymfocytgenoprettelse, selv om procentdelen af genkorrigerede myeloide celler var meget lavere . Fordelene ved GT er bl.a., at der ikke er risiko for transplantation mod værts sygdom, og at behandlingen kan iværksættes hurtigere end ved donorsøgning, når der ikke er en MSD eller MFD til rådighed. Langtidsresultaterne er dog endnu ikke kendt, og der er behov for yderligere overvågning for at opnå en bedre forståelse af de risici, der er forbundet med GT sammenlignet med allogen HSCT eller langtids ERT. Selv om GT med gamma-retrovirale vektorer hidtil har vist en fremragende sikkerhedsprofil, er der for nylig blevet rapporteret om nye udviklinger med lentiviral vektor-medieret GT, som udnytter potentialet til at transducere både ikke-delende og delende celler, og som viser lovende resultater med hensyn til både klinisk effektivitet og sikkerhed .
Langtidsresultater
Transplantation ved hjælp af en MSD eller MFD uden konditionering tidligt efter diagnosen er forbundet med et godt resultat med hensyn til overlevelse og CD3+-genoprettelse i det første år efter HSCT , men der vides kun lidt om det langsigtede resultat og kvaliteten af immunrekonstitutionen hos patienter med ADA-deficient SCID. Udvidet anvendelse af screening af nyfødte for SCID kan bidrage til at forbedre resultaterne yderligere i fremtiden ved at gøre det muligt at identificere spædbørn med SCID (af alle genetiske årsager) før udviklingen af infektioner og andre komplikationer ved hjælp af påvisning af T-celle receptor excisionscirkler (TRECs). TREC’er er DNA-stykker, der udskilles under udviklingen af T-celle-receptoren, og de er et nøjagtigt mål for thymusproduktionen. Patienter med SCID har et betydeligt nedsat antal TREC’er, som kan påvises ved hjælp af tørrede blodpletter fra nyfødte . En tidligere diagnose og en reduceret byrde af komplikationer giver mulighed for hurtigere indgreb og bedre resultater, da undersøgelser viser, at søskende, der diagnosticeres på grundlag af en kendt familiehistorie, har en betydeligt bedre overlevelse . På trods af de positive udsigter med hensyn til immunrekonstitution efter HSCT som rapporteret af Hassan et al. var opfølgningsperioden i denne undersøgelse højst 27,6 år (median 6,5 år) , og der er behov for længere opfølgningsdata for fortsat at evaluere T-lymfocyt-immunitetens varighed, da de første data tyder på, at thymopoiesis er begrænset i ubetingede MFD/MSD HSCT’er, hvilket kan føre til en eventuel udtømning af T-lymfocytrepertoiret . Udsigterne for GT som en terapeutisk mulighed er også lovende, især med udviklingen af raffinerede vektorer og genredigeringsteknologi, men der er behov for yderligere langsigtet opfølgende overvågning. Der foregår også en udvikling med henblik på at forbedre PEG-ADA, og der er et klinisk forsøg i gang, hvor der anvendes et rekombinant kildeenzym som et alternativ til de i øjeblikket anvendte kvægsekvenser . Selv om der ikke er foretaget store prospektive undersøgelser af resultatet af ikke-immunologiske defekter efter endelig behandling, tyder små retrospektive rapporter på, at neurologiske, adfærdsmæssige og audiologiske defekter ikke korrigeres. Der er behov for yderligere undersøgelser for at undersøge, om faktorer som donortype og konditioneringsregime eller behandlingstypen har indflydelse på resultaterne på disse områder. Der er også behov for yderligere forståelse af den underliggende patogenese, der er involveret i de ikke-immune systemiske manifestationer, for at muliggøre optimal undersøgelse og behandling samt for fuldt ud at kunne skelne mellem de metaboliske virkninger af ADA-mangel og virkninger forårsaget af infektiøse agenser.