Citrobacter freundii fitness during bloodstream infection

Sbírka izolátů Citrobacter BSI

V porovnání s jinými gramnegativními druhy, které pravidelně způsobují BSI, je k dispozici jen málo informací o fyziologii C. freundii v prostředí hostitele. S cílem odstranit tento nedostatek jsme nejprve shromáždili osm izolátů patřících do komplexu C. freundii od pacientů s BSI v rámci University of Michigan Health System. Fylogeneze založená na ribozomální RNA je schopna rozlišit tři skupiny druhů Citrobacter, z nichž skupina I zahrnuje nejméně osm druhů a zahrnuje C. freundii23,24 . Nicméně identifikační přístupy založené na sekvenci 16S rRNA a hmotnostní spektrometrii nabízejí v rámci této skupiny druhů Citrobacter omezené fylogenetické rozlišení. Proto byly izoláty použité v této studii dále hodnoceny pomocí přístupu multilokusové sekvenční analýzy. Z osmi odebraných izolátů se šest těsně shlukovalo se zavedenými kmeny C. freundii (obr. 1) a mělo průměrnou nukleotidovou identitu >98 % s typovým kmenem ATCC 8090, což je nad obvykle akceptovanou 95% hranicí pro izoláty stejného druhu. Ze zbývajících dvou izolátů se UMH17 nejvíce shodoval s typovým kmenem Citrobacter pasteurii CIP 55.13 a UMH18 s kmeny Citrobacter werkmanii.

Bakteriémie C. freundii

Před zkoumáním fitness požadavků Citrobactera během BSI byl na základě dřívější práce s jinými střevními druhy vyvinut myší model bakteriémie25. Z izolátů Citrobacter BSI byly jako kandidáti pro použití v této studii vybrány kmeny UMH14 a UMH15. Izolát UMH14 vykazoval konzistentnější kolonizaci sleziny a jater v závislosti na dávce po 24 hodinách od injekce do ocasní žíly (obr. S1) a byl vybrán pro další charakterizaci. Před hodnocením příspěvku jednotlivých genů C. freundii k fitness pomocí rozsáhlé kolekce transpozonových mutantů bylo také nutné otestovat model infekce na potenciální úzká místa kolonizace. Byl izolován spontánní mutant UMH14 rezistentní vůči kyselině nalidixové (UMH14Nal), u něhož byla zjištěna ekvivalentní fitness in vitro při společném pěstování s mateřským kmenem v bohatém médiu (obr. S2). Aby se zjistilo, zda lze v krevním řečišti vytvořit různorodou populaci mutantů bez stochastické ztráty jednotlivých klonů, byly kmeny UMH14Nal a UMH14 smíchány v různých poměrech a naočkovány myším. Po 24 hodinách byly tolerovány poměry až 1:10 000 (UMH14Nal:UMH14) bez spontánní ztráty nedostatečně zastoupeného kmene ve slezině (obr. S2), což naznačuje, že jedna myš může pomocí tohoto modelu pojmout nejméně 10 000 jedinečných transpozonových mutantů při celkové dávce 5 × 107 bakterií.

Pro identifikaci fitness genů Citrobacter v modelu bakteriémie bylo myším injikováno pět poolů náhodných transpozonových inzertních mutantů představujících >44 000 unikátních inzertních míst a po 24 hodinách byly obnoveny bakterie kolonizující slezinu (obr. S3). Relativní množství jednotlivých transpozonových mutantů v inokulaci a ve výstupech ze sleziny, stanovené pomocí vysokokapacitního sekvenování, bylo použito k identifikaci genů, které přispívají k přežívání bakterií v modelu. Celkem 177 genů narušených transpozony způsobilo významnou ztrátu fitness a devět genů bylo spojeno se zvýšením fitness bakterií, pokud byly mutovány (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Data S1). Druhá analýza s tímto souborem dat identifikovala 546 chromozomálně kódovaných domnělých esenciálních genů, pro které byl počet čtení ve vstupní populaci významně nižší, než se očekávalo na základě dostupných míst TA a velikosti knihovní populace (logFC <-5,17) (Data S2). Při použití tohoto modelu oportunní a systémové infekce se předpokládalo, že většina identifikovaných fitness faktorů bude představovat spíše základní fyziologické procesy než prototypické faktory virulence (např. proteinové toxiny nebo adheziny). Kategorizace 177 genů spojených s významnými fitness defekty podle Clusters of Orthologous Groups (COG) skutečně odrážela převahu metabolických drah a buněčných udržovacích funkcí potřebných během bakteriémie C. freundii (obr. 2). Přibližně polovina identifikovaných fitness genů obecně spadá do pěti kategorií COG zahrnujících produkci energie, metabolismus aminokyselin, replikaci a opravu DNA, translaci a biogenezi buněčné stěny a membrán.

Ověření jednotlivých fitness genových mutantů

Příspěvek jednotlivých genových produktů k fitness C. freundii byl potvrzen pomocí nezávislých delečně-inzerčních mutací zkonstruovaných ve vybraných UMH14 genech (tabulka 1). Všechny zde uváděné konstruované kmeny postrádaly hrubé replikační defekty, jak bylo stanoveno růstem v bohatém médiu (obr. S4). Pro každý gen uvedený v tabulce 1 byla fitness měřena koinfekcí jednotlivých mutantů s mateřským kmenem UMH14. Pět ze sedmi původně testovaných mutantů vykazovalo statisticky významnou konkurenční nevýhodu buď ve slezině, nebo v játrech (obr. 3A), čímž potvrdilo výsledky transpozonového screeningu. Mutant znuB byl zde vybrán jako negativní kontrola pro validaci, protože výsledky transpozonového screeningu ukázaly, že s tímto genem není spojena žádná porucha fitness, a to navzdory důkazům z jiných bakteriálních druhů, které prokazují podíl transportního systému zinku ZnuABC na infekci myší26,27,28 . V konkurenci s UMH14 mutant znuB nevykazoval významnou poruchu fitness, což je v souladu s očekávanými výsledky. Sousední geny znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) a znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) UMH14 také nepřinášely žádný nebo minimální defekt fitness, pokud byly mutovány vložením transpozonu (Data S1).

Mutace genu tatC, kódujícího součást systému translokace dvojčat argininu, vedla k největší ztrátě fitness ze všech testovaných mutantů (obr. 3). Aby se zjistilo, zda lze sníženou fitness tohoto mutanta obnovit genetickou komplementací, byl do mutanta tatC vnesen plazmid pBBR1MCS-5 nesoucí otevřený čtecí rámec tatC a byla testována relativní fitness výsledného kmene. Mutant tatC zpočátku vykazoval 67násobnou poruchu fitness ve slezině v konkurenci s kmenem divokého typu (obr. 3A), zatímco komplementovaný mutant tatC vykazoval za stejných podmínek pouze dvojnásobnou poruchu fitness (obr. 3B). Stejně tak komplementovaný mutant tatC nebyl ve srovnání s kmenem UMH14 výrazněji konkurenceschopný v játrech. Je známo, že mateřský plazmid pBBR1MCS-5 se stabilně udržuje během infekce v nepřítomnosti selekce29 a in vitro kultivace mutanta C. freundii tatC nesoucího buď pBBR1MCS-5, nebo komplementační plazmid tatC+ neprokázala v průběhu 24 hodin v nepřítomnosti selekce žádný znatelný úbytek plazmidu (obr. S5). Tyto výsledky společně pevně stanovují požadavek na funkci TatC během bakteriemie Citrobacter.

Zachování fitness genů mezi izoláty Citrobacter

V průběhu této studie byla stanovena kompletní sekvence genomu každého izolátu Citrobacter a předpokládaný proteom každého kmene byl porovnán s UMH14 jako referencí. Ze 4 666 predikovaných genových produktů kódovaných na chromozomu UMH14 je 3 742 konzervováno s ≥ 95 % identitou mezi všemi izoláty C. freundii v této studii (obr. 4A). Počet konzervovaných proteinů (≥95% identita) mezi všemi kmeny se sníží na 2 545, pokud byly zahrnuty predikované proteomy UMH17 a UMH18, což odpovídá zařazení těchto izolátů mimo větev C. freundii na základě multilokusové sekvenční analýzy (obr. 1). Konzervovanost fitness faktorů UMH14 byla také vysoká, 145 z předpokládaných 177 proteinů bylo mezi osmi bakteriálními kmeny konzervováno s ≥95% aminokyselinovou identitou (obr. 4B), včetně všech sedmi původních fitness faktorů, které byly vybrány k validaci (tab. 1 a obr. 3). Vyřazením UMH17 a UMH18 z úvahy se počet konzervovaných fitness faktorů zvýšil na 162 (92 %). Tyto výsledky naznačují strategii přežití Citrobactera během bakteriémie, která je do značné míry závislá na konzervovaných proteinech v rámci druhu. Zajímavé je, že jen málo fitness faktorů bylo v rámci této podskupiny kmenů zcela jedinečných (<30% identita) pro UMH14. Jedním z pozoruhodných příkladů je domnělý třígenový operon (CUC46_23440-CUC46_23450) s pozorovanými fitness defekty v rozmezí 6 až 14násobku. Všechny tři otevřené čtecí rámce kódují hypotetické proteiny a z nich pouze u CUC46_23450 se předpokládá, že kóduje konzervovanou doménu s přiřazenou funkcí (cd01713, fosfoadenosinfosulfátreduktáza).

Druhy rekombinace a opravy DNA

Jedním z cílů této studie bylo identifikovat konzervované biologické dráhy, které zahrnují více fitness faktorů bakterií. Enzymové komplexy RecBCD a RuvABC, které se podílejí na rekombinaci a opravě DNA, představují takový příklad. Enzym RecBCD je aktivní na koncích duplexní DNA a je nezbytný pro procesy homologní rekombinace a rekombinační opravy DNA. S těmito funkcemi souvisí i enzym RuvABC, který usnadňuje migraci a řešení větví Hollidayových spojů30,31. Vložení transpozonu do recB, recC nebo recD vedlo k 6-8násobnému snížení fitness a podobně narušení ruvA i ruvC vložením transpozonu vedlo k >30násobné ztrátě fitness (Data S1). Důležité je, že defekt fitness ruvA byl potvrzen konkurenční infekcí proti kmeni divokého typu pomocí nezávisle zkonstruovaného mutanta (obr. 3A). V rámci obou multiproteinových komplexů nebyl v našem souboru dat identifikován jako významný fitness faktor pouze RuvB. O obou proteinových komplexech je známo, že se podílejí na řešení zastavených nebo zhroucených replikačních vidlic DNA, ke kterým dochází během normální syntézy chromozomů30 , i když je důležité, že mutant ruvA rostl podobně jako kmen divokého typu během rychlé replikace v bohatém médiu (obr. S4). Je lákavé spekulovat, že k požadavku na tyto komplexy může přispívat i poškození bakteriální DNA, ke kterému dochází v hostitelském prostředí, potenciálně prostřednictvím produkce reaktivních forem kyslíku zprostředkovaných imunitními buňkami.

Dvojitý argininový translokační systém

Dvojitý argininový translokační systém funguje u gramnegativních bakteriálních druhů při vylučování složených proteinů přes cytoplazmatickou membránu. Úloha TatC v tomto konzervovaném multiproteinovém systému spočívá v rozpoznávání sekrečních signálních sekvencí pro proteiny, které jsou touto cestou exportovány. Poté, co byl zjištěn významný vliv genu tatC na fitness C. freundii in vivo (obr. 3), byla vyslovena úvaha, že proteiny vylučované systémem Tat mohou být rovněž nezbytné pro fitness na myším modelu. Pro identifikaci předpokládaných proteinů vylučovaných Tat byla analyzována N-koncová sekvence každého ze 177 fitness faktorů pomocí predikčního softwaru TatP 1.032. Dva geny, CUC46_16565 a CUC46_16060, byly identifikovány jako geny kódující signální peptidy závislé na Tat obsahující dvojité argininové motivy. Produkt CUC46_16565 sdílí 94% aminokyselinovou identitu s proteinem E. coli SufI, včetně 100% zachování twin-argininového motivu a hydrofobní části signálního peptidu33. Gen C. freundii sufI byl mutován a fitness byl hodnocen v konkurenci s mateřským kmenem UMH14, aby se zjistilo, zda lze nějakou poruchu fitness spojenou se ztrátou TatC přičíst narušení funkce SufI (obr. 5A). Mutantní kmen sufI byl skutečně 7krát konkurenceschopnější ve slezině a 17krát v játrech ve srovnání s kmenem divokého typu. Protože se však fitness náklady mutace tatC pohybovaly od 67násobku do 112násobku v konkurenci s bakteriemi divokého typu (obr. 3), relativně nízké náklady na fitness mutace sufI naznačují, že k fitness mohou přispívat i další substráty závislé na Tat. Pokusy o zavedení Tat-dependentní sekrece SufI u C. freundii byly neúspěšné kvůli zjevným problémům s toxicitou spojeným s expresí C-terminálního FLAG epitiopem značeného konstruktu SufI, konkrétně v mutantním kmeni tatC (údaje nejsou uvedeny). Nicméně SufI byl použit jako modelový protein vylučovaný Tat v mnoha studiích charakterizujících systém Tat E. coli.

Druhým identifikovaným potenciálním fitness faktorem vylučovaným Tat, kódovaným CUC496_16060, je předpokládaná prolinaminopeptidáza (PRK10879) patřící do nadrodiny PepP. Mutantní kmen, který postrádá gen pepP, byl přibližně 3násobně překonán ve slezině a přibližně 2násobně v játrech, ale pozorovaná fitness nevýhoda ve srovnání s divokým typem nebyla statisticky významná (obr. 5A). Nicméně subcelulární lokalizace PepP byla stanovena pomocí derivátu značeného epitopem C-terminální FLAG, který byl nesen na multikopírovaném plazmidu (PepPFLAG). U mutanta tatC byly zjištěny neočekávaně nízké hladiny PepPFLAG ve srovnání s UMH14; fúzní protein PepPFLAG byl však nalezen především v cytoplazmatické frakci obou testovaných kmenů (obr. S6) a nebyl získán žádný důkaz o subcelulární lokalizaci proteinu PepP v závislosti na Tatu. Společně s výsledky konkurenční infekce mutantů sufI tato data dále podporují domněnku, že u C. freundii jsou přítomny další faktory fitness závislé na Tat nebo že kumulativní ztráta translokace proteinů prostřednictvím systému Tat převažuje nad ztrátou funkce pro jakýkoli jednotlivý substrát.

Jedním z převládajících fenotypů spojených se ztrátou funkce mutantů tat napříč druhy je zhoršení motility34,35,36,37 . C. freundii je bičíkatá bakterie schopná plavecké motility v měkké agarové matrici. Mutant C. freundii tatC vykazoval přibližně dvojnásobné snížení plavecké pohyblivosti ve srovnání s kmenem divokého typu a plavecká pohyblivost byla plně obnovena genetickou komplementací v trans (obr. 5B,C). Tyto výsledky jasně ukazují na poruchu pohyblivosti při absenci funkce tatC; protože však u mutanta tatC bylo stále pozorováno plavání na nízké úrovni, je pravděpodobné, že určitá bičíková funkce zůstala zachována. S výjimkou fliQ naznačuje obecný nedostatek fitness genů spojených s bičíky identifikovaných během bakteriemie, že význam tatC pro fitness C. freundii může být do značné míry nezávislý na dysfunkci bičíků pozorované u tohoto kmene.

Metabolické fitness dráhy

Jak již bylo uvedeno dříve, značná část identifikovaných fitness genů Citrobacteru měla fungovat v metabolických drahách (obr. 2). Pro další zkoumání byly vybrány tři různé geny reprezentující složky centrálního metabolismu uhlíku (pfkA), metabolismu fruktózy a manózy (mtlD) a biosyntézy aminokyselin (cysE). Bakteriální biosyntéza cysteinu probíhá z L-serinu prostřednictvím meziproduktu O-acetyl-L-serinu (OAS). Tento první krok v modelové dráze E. coli je katalyzován enzymem CysE O-acetyltransferasou a ztráta cysE vede k cysteinové auxotrofii38,39 . Mutant C. freundii cysE se rovněž nedokáže replikovat v definovaném médiu s nedostatkem cysteinu (obr. 6A), ale může dosáhnout hustoty blízké divokému typu, pokud bylo médium doplněno buď OAS (obr. 6B), nebo cysteinem (obr. 6C). Genetická komplementace mutace cysE vedla k částečnému obnovení růstu při absenci cysteinu. Je zajímavé, že úplná absence růstu u bakterií mutovaných na cysE v nepřítomnosti OAS nebo cysteinu in vitro je v kontrastu s částečným defektem fitness pozorovaným během infekce (obr. 3A). To naznačuje, že Citrobacter může být schopen získávat tyto metabolity z prostředí krevního řečiště, nicméně s narušením biosyntetické dráhy jsou stále spojeny náklady na fitness.

V rámci našeho zkoumání metabolismu Citrobactera spojeného s hostitelem byla zkoumána schopnost této bakterie využívat různé zdroje uhlíku. Enzym fosfofruktokináza PfkA jiných střevních druhů byl rozsáhle charakterizován a představuje první angažovaný krok v glykolýze, který katalyzuje fosforylaci fruktóza-6-fosfátu na fruktóza-1,6-bisfosfát. U UMH14 mutace pfkA eliminovala schopnost tohoto kmene replikovat se na glukóze jako jediném zdroji uhlíku (obr. 6D), což bylo možné částečně obnovit poskytnutím pfkA na vícekopiovém plazmidu. Tato úplná ztráta utilizace glukózy in vitro korelovala s dvojnásobným poklesem fitness během bakteriemie (obr. 3A). Vzhledem k tomu, že glukosa je hojným zdrojem uhlíku v séru savců40 , jsou tyto výsledky v souladu s úlohou, kterou pro Citrobacter hraje využití glukosy během infekce, ale také naznačují, že metabolický repertoár Citrobacter může usnadnit využití alternativních zdrojů uhlíku a energie.

Byl také zkoumán příspěvek druhé enzymatické aktivity zahrnující fruktosa-6-fosfát k bakteriemii Citrobacter. Protein mannitol-1-fosfát-5-dehydrogenázy, MtlD, usnadňuje obousměrnou přeměnu mannitol-1-fosfátu a fruktosa-6-fosfátu za použití NAD+ nebo NADH jako kofaktoru41,42 . Řada střevních bakteriálních druhů může využívat cukerný alkohol mannitol jako jediný zdroj uhlíku po transportu prostřednictvím fosfoenolpyruvát-dependentního fosfotransferázového systému hexitolu, což vede k intracelulární akumulaci mannitol-1-fosfátu43,44 . Jedním z možných osudů mannitol-1-fosfátu je oxidace závislá na MtlD na fruktosa-6-fosfát a jeho následný vstup do glykolytické dráhy. Mutant C. freundii mtlD vykazoval pětinásobný pokles fitness v myších játrech (obr. 3A) a toto pozorování podnítilo experimenty s cílem zjistit, zda je C. freundii schopna tohoto typu metabolismu in vitro. Kmeny UMH14 a kmeny odvozené od mtlD byly kultivovány v definovaném médiu obsahujícím mannitol a výsledné růstové křivky ukazují, že bakterie divokého typu a komplementovaný mutant se za těchto podmínek dokázaly množit, zatímco kmen mtlD nikoli (obr. 6E). Podle očekávání se mutant mtlD dokázal rozmnožit na úroveň blízkou divokému typu, pokud mu byla jako zdroj uhlíku poskytnuta glukóza za aerobních podmínek (obr. 6F). Tyto výsledky společně potvrzují jak schopnost C. freundii využívat manitol jako jediný zdroj uhlíku, tak požadavek na mtlD v tomto procesu.

Sdílené fitness strategie mezi patogeny v prostředí krevního řečiště

Předtím jsme hodnotili fitness požadavky jiného oportunního patogenu, S. marcescens, pomocí podobného myšího modelu bakteriémie. Výsledky studie S. marcescens zahrnovaly identifikaci 212 fitness genů pomocí technik podobných této práci45. Ve snaze zjistit, zda tyto druhy sdílejí nějaké společné cesty pro fitness během BSI, byly nejprve porovnány předpokládané proteomy obou druhů. Proteiny byly považovány za homologní mezi C. freundii a S. marcescens, pokud sdílely ≥ 70 % aminokyselinové identity na ≥ 50 % sekvence. Celkem bylo identifikováno 42 homologních proteinů jako významných fitness faktorů u obou organismů (tabulka S1), přičemž v tomto seznamu sdílených fitness faktorů je zastoupena řada různorodých funkcí. Pozoruhodné je, že protein RuvA, jehož ztráta vedla ke >10násobnému snížení fitness C. freundii při konkurenční infekci (obr. 3A), byl spolu s RuvC identifikován jako fitness faktor u S. marcescens. Tyto výsledky dále podporují hypotézu, že řešení komplexů Hollidayových spojů, potenciálně během rekombinační opravy poškození DNA, je důležité pro fitness in vivo těchto organismů. Enzym fosfofruktokináza PfkA byl rovněž identifikován jako fitness faktor u obou druhů. Stejně jako u Citrobactera je pfkA u S. marcescens nutná pro využití glukózy jako jediného zdroje uhlíku a dále byla nutná pro optimální replikaci bakterií v tepelně inaktivovaném lidském séru45. U obou organismů pfkA přispíval k fitness ve slezině, jak bylo hodnoceno transpozonovým screeningem, ačkoli je zajímavé, že mutant S. marcescens pfkA vykazoval také přibližně 9krát nižší fitness v ledvinách při konkurenční infekci s kmenem divokého typu. V průběhu této práce bylo zjištěno, že kmen C. freundii UMH14 divokého typu vykazoval v modelu BSI poměrně slabou kolonizaci ledvin, ale bylo prokázáno, že gen pfkA Proteus mirabilis přispívá k fitness v ledvinách po infekci močových cest46. Tyto výsledky společně ukazují možnost identifikace konzervovaných fitness strategií napříč organismy ve specifickém prostředí. Bude zapotřebí další práce, aby se zjistilo, zda jsou tyto genové produkty vyžadovány i u dalších organismů způsobujících BSI a zda lze tyto konzervované fitness dráhy využít.

.