4. prosince jsem navštívil Kliniku pro zvláštní děti v srdci holandské Pensylvánie, kde se malý personál stará o více než 2000 pacientů s různými dědičnými chorobami. Příspěvek z minulého týdne popisoval rodinu, v níž má 5 ze 6 dětí záchvatovitou poruchu, která zahrnuje i autistické rysy. Vyšetřování tohoto syndromu v posledních 15 letech krásně ilustruje vývoj metod objevování genů předtím, než nás sekvenování katapultovalo do nového technologického věku. (Varování: žargon před námi.)
PŘIPOJENÍ FENOTYPU KE GENOTYPU
Dnes vědci při identifikaci genu, který stojí za nediagnostikovaným onemocněním dítěte, porovnávají sekvence exomu (část genomu kódující bílkoviny) rodičů a případně sourozenců, aby identifikovali příčinné varianty (alely) genu. Je to rychlé.
V předgenomové éře se vědci dostali od fenotypu ke genotypu nepřímou cestou:
– zjištění, že příznaky „se vyskytují v rodinách“.
– zjištění, že onemocnění je častější u jednovaječných dvojčat než u dvojčat bratrských a u sourozenců pacientů než v běžné populaci.
– identifikace abnormálních chromozomů u lidí s tímto onemocněním.
– Použití celogenomových asociačních studií (GWAS) k identifikaci vzorců genetické variability (v souborech jednobázových míst nazývaných jednonukleotidové polymorfismy neboli SNP), které by mohly označovat variantu způsobující onemocnění.
– Identifikace genu a vytvoření myšího modelu k testování léčby.
Když Amišové na počátku 17. století opustili Švýcarsko, aby unikli náboženskému pronásledování, a usadili se v Pensylvánii, přinesli s sebou vzorek evropského genofondu. Rozmnožování mezi sebou posílilo mutace a vedlo ke vzniku „runů autozygotnosti“ v jejich genomech – úseků chromozomů, které mají na obou kopiích stejné sekvence DNA. Projevy autozygotnosti naznačují, že dva příbuzní zdědili sady genových variant od společného předka, například bratranci a sestřenice z druhého kolena od praprarodičů. Tyto alely, označované jako „identické podle původu“ (IDB), jsou mocným nástrojem pro objevování genů, pokud se objevují výhradně u lidí, kteří mají stejnou nemoc.
SOUHLAS AMISH
Chlapec, kterého jsem poznal na klinice, a 4 z jeho 5 sourozenců mají syndrom kortikální dysplazie a fokální epilepsie (CDFE). Vzniká kvůli jediné chybějící bázi DNA v genu zvaném CNTNAP2.
Stejně jako mnoho jiných příběhů o objevu genů, i zjištění, že mutace v genu CNTNAP2 stojí za celou řadou mozkových onemocnění – autismem, záchvaty, schizofrenií, Tourettovým syndromem a poruchami řeči – začalo různými nitkami. Zaměřme se na souvislost s autismem.
Ji nejstarší genetické techniky prokazují dědičnou složku autismu. U jednovaječných dvojčat je mnohem větší pravděpodobnost, že ho budou mít obě než u dvojčat bratrských; u sourozenců dítěte s autismem je riziko 75krát vyšší než u běžné populace.
V roce 1998 použilo Mezinárodní konsorcium pro molekulárně genetické studie autismu metodu GWAS k identifikaci 6 oblastí v genomu, které byly sledovány u lidí s autismem – hlavní kandidát se nacházel na dlouhém raménku sedmého největšího chromozomu neboli „7q“.
V roce 1999 vědci do případu zapojili CASPR2, typ proteinu zvaného neurexin, který při abnormálním stavu narušuje vysílání nervového impulsu. Neurexiny se spojují s dalšími bílkovinami zvanými neuroliginy a vytvářejí synapse, které vznikají, když malé dítě začíná zkoumat svět, a upevňují paměť v učení.
V roce 2003 přišly zprávy o přestavbě chromozomů, která narušuje gen kódující CASPR2, CNTNAP2, u lidí s Tourettovým syndromem a v roce 2007 u lidí, kteří mají mentální postižení, opožděný vývoj, poruchy řeči a hyperaktivitu, ale ne Tourettův syndrom. Tyto rozdílné stavy nejsou překvapivé – účinky se liší podle toho, kde v mozku je hladina neurexinu nevyvážená.
V roce 2006 vědci z Kliniky pro zvláštní děti a Institutu pro výzkum translační genomiky přiřadili mutaci v CNTNAP2 k syndromu CDFE u blízce příbuzných amišských dětí. Záchvaty začínají přibližně ve věku, kdy se obvykle objevují autistické rysy – 14 až 20 měsíců.
Před začátkem záchvatů jsou příznaky CDFE nenápadné: drobná motorická opoždění, slabé hluboké šlachové reflexy a mírně zvětšená hlava. Děti mají potíže se soustředěním, napodobováním lidí a plánováním pohybů, jako je plazení, křižování a chůze. Záchvaty jsou časté a těžké a jejich nástup předznamenává úbytek schopností – jazykových, kognitivních a sociálních. Po několika letech záchvaty ustávají, ale intelekt zůstává v dětství stagnovat a jedinec vyžaduje celoživotní péči.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, a Holmes Morton, MD, z kliniky a jejich kolegové použili zařízení 100 000-SNP microarray k analýze DNA čtyř dětí se syndromem CDFE ze tří amišských rodin. V podezřelé oblasti na 7q našli autozygotní oblast o délce 7,1 milionu bází. (Dnešní algoritmy rychle odhalí autozygotnost v sekvencích exomu.)
Těchto 7,1 milionu bází zahrnuje 83 genů, ale jen některé z nich dávaly smysl. Tým nejprve sekvenoval gen CENTG3, který je známý jako příčina jiných mozkových poruch. Nemocné děti v něm však mutace neměly.
Poté doktor Puffenberger, genetik z týmu, našel zkratku: všiml si jednoho SNP uprostřed genu CENTG3, který byl u dvou dětí heterozygotní (dvě různé varianty), nikoli homozygotní (stejná varianta v obou kopiích chromozomu), což znamenalo konec oblasti identické podle původu. „Rekombinační událost uprostřed genu umožnila Erikovi zbavit se jeho velké části a najít mutaci. Je to dokonalý příklad toho, že ‚náhoda přeje připraveným‘,“ řekl mi doktor Morton. Tento objev zkrátil zájmovou oblast na 7q na 3,8 milionu bází.
Druhý kandidátský gen, CNTNAP2, se rozkládá napříč zájmovou oblastí. Každému dítěti tam chyběla jedna báze z obou kopií chromozomu 7 a každý z rodičů měl stejnou mutaci, ale jen v jedné kopii. Jsou to přenašeči. Byl to první Mendelův zákon v praxi.
Tým našel svůj gen. Pak pátrali dál v komunitě a mezi 105 zdravými Amiši byli čtyři přenašeči. Devět z 18 pacientů ze 7 rodin, kteří měli parciální záchvaty, ale bez konkrétní diagnózy, mělo syndrom CDFE.
Záchvaty byly záhadné. „Jedna mutace může způsobovat různé typy záchvatů. Čtyři děti v jedné rodině reagují různě. Některé jsou velmi postižené, jiné ne,“ uvedl doktor Morton. Tři děti podstoupily operaci, která měla záchvaty zmírnit, ale úleva netrvala dlouho. Operace však poskytly vzorky mozkové tkáně, které vědcům umožnily lépe popsat, co se děje špatně.
Spojení v mozcích náchylných k záchvatům je chaotické. Hranice šedé a bílé hmoty se stírají a některé části mozkové kůry jsou ztluštělé. Samotné neurony nejsou zcela v pořádku. Jsou příliš kulaté, příliš natěsno, s vyšinutými dendritickými stromy. Tečky na neuronech naznačují příliš mnoho jader z glie, podpůrných buněk, které tvoří většinu nervového systému. Výzkumná zpráva z roku 2006 byla poetická a popisovala amygdalu, sídlo emocí, v mozcích epileptiků jako „excentrické mikroskopické ostrůvky částečně vyzrálých neuronálních prekurzorů v těsných shlucích“ zahalených v amoku glie.
Portrét amišského epileptického mozku dával smysl ve světle práce o neurexinovém proteinu CASPR2 (což znamená contactin-associated protein-like 2). Neurexin tvoří lešení v Ranvierových uzlech. Uzly jsou exponovaná místa na axonu mezi polštáři myelinu, izolačního materiálu, což jsou vlastně buněčné membrány glie omotané kolem neuronu jako náplast kolem prstu. Nervové impulzy překonávají uzly a posílají zprávy dostatečně rychle na to, aby udržely život.
Bílkoviny CASPR2 u amišských dětí jsou zakrnělé. Neprojíždějí buněčnými membránami neuronů a neponořují se do cytoplazmy, jak by měly, a v důsledku toho dochází ke kolapsu blízkých draslíkových kanálů. Tyto kanály za normálních okolností umožňují draslíkovým iontům vyrazit z nervových buněk při průchodu impulzu a resetovat je. Bez neurexinového lešení se tedy neuron nemůže resetovat. Přenos se zastaví. A nějakým způsobem začnou záchvaty. Myslím, že není známo, zda záchvaty vyvolávají autistické rysy, nebo vznikají přímo – to by měly ukázat další genetické studie.
MODEL MYŠLENKY
Daniel Geschwind, doktor medicíny a profesor neurologie na David Geffen School of Medicine na Kalifornské univerzitě v Los Angeles, pracoval na autistických genech a v roce 2006 si přečetl článek v New England Journal of Medicine. „Zavolal mi a řekl: ‚Našli jste můj gen!‘ Začala příjemná spolupráce a on vytvořil myš s autistickou mutací,“ řekl doktor Morton. Myši mají vyřazený gen CNTNAP2 a stejně jako lidé mají záchvaty a autistické rysy.
„Myš obvykle běhá po kleci, je normálně společenská a žvatlá. Tyto myši nebyly ani jedno,“ vysvětlil doktor Morton. Myši také vykazovaly repetitivní chování a měly záchvaty.
Mozky mutantních myší vykazovaly abnormální vzorec propojení připomínající dřívější histologické práce. „Přední část mozku hovoří převážně sama se sebou. Nekomunikuje tolik s ostatními částmi mozku a postrádá dálková spojení se zadní částí mozku,“ řekl Dr. Geschwind. Skupina prokázala podobné abnormality v mozku dětí s autismem.
Nápadná podobnost mezi autistickými dětmi a myšmi poskytuje testovací pole pro léky. Risperidon, předepisovaný k léčbě opakovaného chování u dětí, měl na myši stejný účinek a zároveň zlepšil jejich schopnost stavět hnízda. Tento lék však dětem nepomáhá při socializaci.
Zjevným kandidátem na lék zlepšující sociální dovednosti je „hormon lásky“ oxytocin. Ten se hojně vyskytuje ve stejných mozkových neuronech, které jsou bohaté na protein CASPR2. Mohlo by příliš málo oxytocinu způsobit autistické rysy? Výsledky doplňování oxytocinu jsou slibné, a to jak u myší, tak u dětí.
Dr. Geschwind a spolupracovníci zjistili, že nosní sprej s oxytocinem „dramaticky zlepšuje sociální deficity“ u myší. Protože neautistické myši nereagovaly, zdá se, že hormon skutečně kompenzuje deficit.
Amští farmáři už dávají oxytocin kravám, aby stáhly děložní svaly, a vzpomínám si, že jsem ho dostal, abych oživil zastavený porod. Ale doma to nezkoušejte. Probíhá několik klinických studií oxytocinu nebo léků, které zvyšují jeho aktivitu v mozku, s cílem zlepšit socializaci u dětí s autismem.
Autism Speaks financoval první klinickou studii oxytocinu v roce 2010 a NIH sponzoruje větší probíhající studii oxytocinového nosního spreje. Ale pokud vím, pacienti byli zařazeni na základě klinických diagnóz podle DSM-IV – nikoliv na základě specifičtějšího kritéria genotypu.
Ačkoliv nápad vyzkoušet oxytocin ke zlepšení sociálních příznaků u autismu nevyžadoval znalost základní mutace, taková informace může zpřesnit jakékoli závěry zohledněním mechanismu – což může vést k vývoji dalších léčebných postupů. V jiném příspěvku se budu zabývat tím, jak genetická přesnost umožnila doktoru Mortonovi vyvinout léky na některé vrozené chyby metabolismu, které jsou mnohem častější u Amišů, ale přesto se objevují na novorozeneckých screenech všech lidí.
.