Albers-Schönbergova choroba (autozomálně dominantní osteopetróza, typ II) je důsledkem mutací v genu pro chloridový kanál ClCN7

Abstract

Albers-Schönbergova choroba neboli autozomálně dominantní osteopetróza, typ II (ADO II), je nejčastější formou osteopetrózy, skupiny onemocnění charakterizovaných zvýšenou hmotností skeletu v důsledku poruchy resorpce kostí a chrupavek. Po přiřazení genu způsobujícího ADO II k chromozomu 16p13.3 nyní uvádíme sedm různých mutací v genu kódujícím chloridový kanál ClCN7 u všech 12 analyzovaných rodin s ADO II. Navíc byl identifikován pacient s těžkou, autozomálně recesivní, dětskou formou osteopetrózy (ARO), který byl homozygotní pro mutaci ClCN7. Z korelace genotyp-fenotyp se zdá, že ADO II odráží dominantní negativní účinek, zatímco mutace ztráty funkce v ClCN7 nezpůsobují abnormality u heterozygotních jedinců. Protože někteří pacienti s ARO mají mutace v obou kopiích genu ClCN7, je ADO II alelický u podskupiny případů ARO.

Přijato 2. října 2001; Revised and Accepted 11. října 2001.

ÚVOD

Ve zdraví je remodelace kostní tkáně výsledkem vyvážených procesů tvorby a resorpce kosti. Nadměrná resorpce způsobuje osteoporózu, která je příčinou většiny netraumatických zlomenin (1). Naopak defektní kostní resorpce způsobuje osteopetrózu charakterizovanou hustými, ale obvykle křehkými kostmi. U lidí bylo popsáno nejméně osm typů osteopetrózy (2). Deficit izoenzymu karboanhydrázy II způsobuje autozomálně recesivní osteopetrózu (ARO) s renální tubulární acidózou a mozkovými kalcifikacemi (3; MIM 259730), zatímco většina případů maligní ARO (4; MIM 259700) odráží mutace v genu TCIRG1 (5,6). Některé vzácné případy osteopetrózy, zřejmě s autozomálně recesivním způsobem dědičnosti, se vyznačují mírnějším fenotypem, a proto se nazývají „intermediární“ forma (7,8; MIM 259710).

Autosomálně dominantní osteopetróza (ADO) je mnohem častější než její recesivní protějšky (9). Vzhledem k jejímu relativně benignímu klinickému obrazu, kdy je mnoho pacientů asymptomatických a odhalí se pouze na základě náhodného radiografického vyšetření, je však prevalence ADO podhodnocena. Mezi rodinami s ADO jsou obecně uváděny dva podtypy založené především na radiografických znacích (10,11). Typ I (ADOI) se vyznačuje generalizovanou, difuzní osteosklerózou postihující zejména klenbu lební (11). Typ II (ADO II; MIM 166600), forma původně popsaná v roce 1904 Albersem-Schönbergem (12), je nejčastější formou s odhadovanou prevalencí až 5,5/100 000 (13). Klinické projevy zahrnují netraumatické zlomeniny, zejména dlouhých kostí, obrny lebečních nervů, osteoartrózu kyčle a osteomyelitidu dolní čelisti (14). ADO II se rentgenograficky projevuje segmentární osteosklerózou, převážně v oblasti obratlových plotének („rugger jersey spine“), ilických křídel („bone within bone“ sign) a lební baze (9) (obr. 1).

Nedávno jsme na základě celogenomového hledání přiřadili gen, který je základem ADO II, na chromozom 16p13.3 (15). Zajímavé je, že gen kódující chloridový kanál ClCN7 se nachází v kandidátské oblasti 8,4 cM (16). Chloridový kanál je totiž nezbytný pro okyselení extracelulární resorpční lakuny nutné pro osteoklasty zprostředkovanou degradaci kostní tkáně (17) a je mutován u jednoho pacienta s ARO (17). Proto jsme ClCN7 považovali za poziční i funkční kandidátský gen způsobující Albersovu-Schönbergovu chorobu.

VÝSLEDKY

Mutační analýza rodin ADO II

Protože je genomická sekvence zahrnující gen ClCN7 dostupná ze sekvenčních databází (GenBank přístupová čísla AL031600 a AL031705), je možná mutační analýza exonů a intron-exonových hranic pomocí genomické DNA. Toto úsilí odhalilo sedm charakteristických mutací v ClCN7 (obr. 2) ve 12 nepříbuzných rodinách ADO II (tab. 1). Pět mutací je missense, jedna vede k deleci jedné aminokyseliny a jedna odstraňuje dva nukleotidy a způsobuje frameshift ovlivňující C-terminální konec proteinu. Žádná z těchto mutací nebyla nalezena ve 100 kontrolních chromozomech.

Čtyři mutace jsou redundantní mutace. Mutace 2423delAG byla identifikována v rodině z Francie a v jedné americké rodině. Mutace G215R se vyskytla ve francouzské, dánské a americké rodině. Mutace P249L byla nalezena ve francouzské a německé rodině. A konečně mutace R767W byla identifikována ve francouzské a americké rodině (tabulka 1). Rozdílný geografický původ studovaných rodin, stejně jako analýza mikrosatelitních markerů lemujících gen ClCN7 (údaje nejsou uvedeny), naznačují, že se jedná o nezávislé mutace, tj. nedědí se od společného předka.

Analýza mutací u pacienta s ARO

Analýza vazeb s markery z chromozomu 16p13.3 jasně prokázala homozygotnost pro všechny markery u pacienta s ARO narozeného z konsanguinních, zdravých rodičů (údaje nejsou uvedeny). Proto byla provedena mutační analýza ClCN7, která prokázala homozygotní missense mutaci na pozici 766 (L766P) (obr. 2). Oba rodiče jsou pro tuto mutaci heterozygotní.

Pozice a zachování mutovaných aminokyselin

Transmembránová topologie navržená pro chloridové kanály ClC předpokládá 10-12 transmembránových domén (18). Všech pět aminokyselin, kterých se týkají missense mutace ADO II, stejně jako mutace, která se vyskytla u pacienta s ARO, je vysoce konzervovaných mezi různými členy rodiny genů pro chloridové kanály ClC (obr. 3). Mutace G215R a P249L jsou opakující se mutace nalezené u pacientů tří, respektive dvou nepříbuzných rodin (tabulka 1). G215 je vysoce konzervovaný zbytek nacházející se mezi D2 a D3 (obr. 4), tedy v oblasti, o které je známo, že ovlivňuje vlastnosti pórů kanálů (19), zatímco P249 se podílí na vysoce konzervovaném, strukturním prvku tvořícím podstatnou část pórů kanálů ClC (20). R286 se nachází v extracelulárním prostoru, těsně za transmembránovou doménou D5. Tato aminokyselina je konzervována mezi různými proteiny ClC, s výjimkou ClC1 a ClC2, které mají v této oblasti proteinu divergentní sekvenci. Zbývající dvě mutace ADO II a mutace ARO se nacházejí v cytosolové, C-terminální části proteinu zahrnující sousední aminokyseliny. G765, L766 a R767 se nacházejí v úseku D13, který se shoduje s druhou CBS (cystathionin-β-syntázovou) doménou popsanou u proteinu CLCN7 (21). Všechny tři mutace jsou lokalizovány v β2-řetězci CBS domény, v níž byly zaznamenány mutace způsobující lidská onemocnění (22). Přesná funkce této domény je stále nejasná, ale předpokládá se její úloha při třídění proteinů (21).

Konečně dvě malé delece se týkají aminokyselin z intracelulární C-koncové části ClCN7. Aminokyselina L688, deletovaná u jednoho pacienta, se nachází mezi dvěma CBS doménami, zatímco delece dvou nukleotidů začínající v nukleotidové pozici 2423 vede u dvou nepříbuzných rodin k proteinu, který se od divokého typu ClCN7 liší pouze v posledních 10 aminokyselinách.

DISKUSE

Osteopetrózy u savců tvoří heterogenní skupinu stavů zahrnující nejméně osm různých klinických jednotek u lidí (2) a asi devět spontánních zvířecích mutací (23). Myší modely s knockoutem několika genů navíc způsobují osteopetrózní fenotypy, což ilustruje rozmanitost faktorů podílejících se na diferenciaci a aktivaci osteoklastů (23).

Nedávno byla heterogenita u lidských osteopetróz podtržena genetickou heterogenitou i v rámci podtypu ADO II (24,25). Toto odhalení vycházelo z vazebné studie zahrnující rozvětvenou dánskou rodinu, která přiřadila gen ADO II na chromozom 1p21 (26). Toto přiřazení však nebylo potvrzeno ve studiích dalších rodin s ADO II. Ve skutečnosti jsme v naší nedávné vazebné studii zahrnující šest rodin s ADO II lokalizovali gen způsobující onemocnění na chromozom 16p13.3 a ve stejné dánské rodině jsme zjistili kosegregaci mezi ADO II a haplotypem na chromozomu 16p13.3 (15). Proto jsme se domnívali, že důkaz vazby na chromozom 1p21 v této rodině odráží náhodnou kosegregaci. V této studii jsme tuto hypotézu potvrdili identifikací mutace způsobující onemocnění (G215R) v genu ClCN7 v této dánské rodině. Tato skutečnost a fakt, že mutace v tomto genu byly nalezeny ve všech 12 analyzovaných rodinách ADO II, naznačuje, že ADO II je geneticky homogenní.

Naše výsledky také ilustrují, že ADO II je alelická s podskupinou pacientů s těžkou, autozomálně recesivní, infantilní formou osteopetrózy. Již dříve byl jeden pacient s ARO popsán jako složený heterozygot pro nonsense mutaci (Q555X) a missense mutaci (R762Q) v genu ClCN7 (17). Nyní jsme u dalšího pacienta s ARO nalezli homozygotní mutaci (L766P).

Obrázek 5 znázorňuje naši korelaci mezi různými genotypy a fenotypy. Jak ukazuje fenotyp knockoutované myši ClC-7, úplná ztráta funkce chloridového kanálu ClC-7 způsobuje těžkou osteopetrózu, jakou pozorujeme u pacientů s ARO. Protože mutace ClCN7 byly dosud charakterizovány pouze u dvou pacientů s ARO, není možné zjistit, zda případné fenotypové rozdíly odrážejí povahu jejich mutací. Některé vzácné případy osteopetrózy mají „přechodnou“ formu. V těchto případech se předpokládá autozomálně recesivní způsob dědičnosti, ale fenotyp je mírnější než u ARO (7,8). Možná jsou tyto případy způsobeny kombinací dvou mutací v ClCN7, z nichž každá pouze mírně snižuje schopnost vedení Cl-.

Zde uváděné mutace ADO II jsou především missense mutace zahrnující konzervované aminokyseliny (obr. 3 a 4). Zbývající dvě mutace jsou malé delece, které rovněž zachovávají hlavní anatomii chloridového kanálu, a proto s největší pravděpodobností vedou k účinkům srovnatelným s missense mutacemi. Protože se zdá, že chloridové kanály jsou uspořádány jako multimery, pravděpodobně dimery (27), tyto mutace pravděpodobně zhoršují jejich funkci v důsledku dominantně negativních účinků. S takovými účinky nebude většina chloridových kanálů fungovat, což vysvětluje fenotypové abnormality.

Obecně jsou rodiče pacientů s ARO fenotypově normální. Předpokládáme, že to odráží skutečnost, že haploinsuficience tohoto genu s největší pravděpodobností nezpůsobují klinické komplikace ani radiografické nálezy. Případně to může být v některých případech způsobeno sníženou penetrancí ADO II. Rodiče pacienta s ARO prezentovaného v této studii nemají žádné klinické příznaky ADO II, ale radiografické vyšetření nebylo k dispozici.

Alelickou povahu ADO II a ARO podporuje zpráva o rozšířené rodině segregující ADO II, v níž se u jednoho jedince projevila ARO (28). Je možné, že v této rodině způsobuje ADO II mutovaný gen ClCN7 s dominantně negativním účinkem, který se pak shoduje s mutací de novo, nebo s mutací zděděnou od druhého rodiče způsobující ARO. Navrhované vysvětlení dominantní i recesivní formy osteopetrózy spojené s mutacemi ClCN7 je obdobou mutací v genu ClC-1 způsobujících myotonii. Mutace vedoucí ke ztrátě ClC-1 způsobují autozomální, recesivní formu (Beckerův typ) (29), zatímco missense mutace se projevují méně závažnou, autozomálně dominantní formou (Thomsenův typ) (30).

Závěrem uvádíme, že většina, ne-li všechny případy ADO II jsou způsobeny mutacemi v genu ClCN7. Na základě povahy mutací ClCN7 je fenotyp ADO II pravděpodobně výsledkem dominantního negativního účinku. Naše zjištění podporují hypotézu, že chloridové kanály obecně fungují jako homomultimery. Navíc naše studie ilustruje alelickou povahu ADO II a podskupinu případů ARO.

MATERIÁL A METODY

Rodiny a pacienti

Rodiny A-F byly popsány již dříve, protože byly použity k lokalizaci genu pro Albers-Schönbergovu chorobu na chromozomu 16p13.3 (15). Vzorky G-L pocházejí od postižených jedinců z rodin s anamnézou Albers-Schönbergovy choroby a několik jich bylo také popsáno (31-33) (tabulka 1).

Rodina M žije ve Spojených státech, ale má čínské předky. Prosperita je dítětem zdravého páru a narodila se po plnohodnotné graviditě. Rodiče jsou bratranci a sestřenice z druhého kolene. ARO byla diagnostikována ve věku 3 měsíců, když se dostavila do lékařského centra newyorské nemocnice v Queensu se Zvonkovou obrnou. Radiografické vyšetření skeletu odhalilo těžkou osteopetrózu a několik nedislokovaných šikmých zlomenin. Měla anémii, retikulocytózu, hepatosplenomegalii a mírnou atrofii zrakového nervu. Dítě podstoupilo neshodnou alogenní transplantaci dřeně, ale zemřelo ve věku 18 měsíců na sepsi a respirační selhání.

Mutační analýza

DNA byla izolována z krve standardními postupy. Intronové primery (tabulka 2) amplifikující všechny kódující exony a intron-exonové hranice ClCN7 byly navrženy z genomových sekvencí (GenBank přístupová čísla AL031600 a AL031705). 25 exonů bylo amplifikováno z genomické DNA Taq-polymerázou nebo pomocí PCR enhancer systému (Gibco BRL), s koncentrací enhanceru 1×. U všech amplifikací bylo provedeno 30 cyklů při teplotě uvedené v tabulce 2.

Produkty PCR byly přečištěny pomocí purifikačního systému Concert Rapid PCR (Life Technologies) a přímo sekvenovány s primery použitými pro amplifikaci pomocí terminátorové chemie Big-Dye (Perkin-Elmer) na automatickém sekvenátoru ABI 3100. Amplifikace exonu 9 vedla k získání fragmentu proměnlivé délky, protože tento exon navazuje na tandemovou repetici 50 bp sekvence s proměnlivým počtem kopií. V našem souboru vzorků se počet kopií pohyboval mezi čtyřmi a sedmi opakováními. Tato repetice také v některých vzorcích interferuje se sekvenováním tohoto exonu v přímém směru.

Všechny exony, ve kterých byly zjištěny předpokládané mutace, byly sekvenovány ve 100 kontrolních chromozomech bez nálezu mutací.

PODĚKOVÁNÍ

Děkujeme pacientům a rodinám i lékařům, kteří nám poskytli materiál. Tento výzkum byl podpořen grantem (G.0404.00) od „Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek“ (FWO) pro W.V.H. Tento výzkum byl rovněž podpořen granty od „Société Française de Rhumatologie“ (SFR), „Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris“ (FERCMHP) a Shriners Hospital for Children (č. 8540).

.