Aparțin unui grup de interes în hematologie și mă bucur întotdeauna să văd studiile de caz și întrebările pe care le postează alți tehnicieni. Acest grup este multinațional, așa că văd postări de la tehnicieni din toată lumea. Este interesant să vezi asemănările și diferențele dintre practicile standard de operare și rolurile pe care le joacă tehnicienii în diferite zone și în diferite țări. Este, de asemenea, interesant de observat că ne confruntăm cu toții cu aceleași tipuri de probleme și specimene dificile!În ultimele câteva luni, în acest grup de interes în hematologie, am văzut multe întrebări și comentarii despre rezolvarea trombocitelor aglomerate și, prin urmare, folosesc această ocazie pentru a face puțină lumină asupra acestor specimene dificile. Cazul pe care îl prezint, precum și fotografiile, sunt oferite de Abu Jad Caesar, care este manager de laborator la Medicare Laboratories – filiala Tulkarm, în Palestina.
Pacientului i s-a efectuat un CBC pe un Nihon Kohden 6410. WBC a fost de 12,7 x 103μL, numărul de trombocite prin impedanță a fost de 20.000/μL la rularea inițială, ceilalți parametri au apărut în limite normale. Proba a fost încălzită și a fost solicitat un tub cu citrat de Na pentru a exclude pseudotrombocitopenia. după încălzire, EDTA a fost reluată cu un număr de trombocite de 0/μL. Tubul de citrat de Na Citrate a fost efectuat, iar numărul de trombocite de la instrument a fost de 189.000/μL. (Figura 1) Din cauza raportului sânge:anticoagulant în tubul de Citrat de Na, s-a aplicat un multiplicator de 1,1, ceea ce a făcut ca numărul de trombocite de Citrat de Na să fie de 207.900/μL. S-au realizat lamele, au fost colorate și examinate. Imaginea 1 arată aglomerarea în tubul cu EDTA. Imaginea 2 arată frotiul din tubul cu Citrat de Na Citrat, fără aglomerare vizuală.
Hematograma a fost raportată cu următoarele comentarii: S-a observat aglomerarea plachetară, 2 probe prelevate pentru a exclude trombocitopenia. În frotiul de sânge integral cu EDTA s-au observat multe aglomerări de trombocite (trombocitopenie indusă de EDTA). Concluzii: Trombocitele sunt adecvate și se estimează a fi de aproximativ 200.000/μL.
Conturile de trombocite în intervalul normal nu ne dau de obicei prea multe probleme la raportare, chiar dacă sunt prezente unele aglomerări, în principal pentru că sunt normale. Un număr adecvat de trombocite se încadrează într-un interval de referință tipicde aproximativ 150- 450 x 103/μL.Dacă există semnale ale instrumentului pentru o dispersie anormală a trombocitelor sau aglomerări de trombocite, se recomandă repetarea testării prin altă metodă. Dacă numărătoarea inițială este efectuată prin numărare prin impedanță, multe analizoare pot, de asemenea, număra trombocite optice sau fluorescente. La numărarea prin impedanță, hematii sau fragmente foarte mici pot fi numărate ca trombocite, dând astfel un număr fals crescut de trombocite. La numărarea optică, trombocitele mari pot fi numărate ca fiind hematii, dând astfel un număr fals scăzut. Unele analizoare de hematologie Sysmex utilizează numărarea prin impedanță și optică și dispun, de asemenea, de numărarea fluorescentă a trombocitelor, care utilizează un colorant specific trombocitelor și oferă o numărătoare exactă a trombocitelor fără interferențele altor metode. Un număr normal de trombocite, chiar și cu aglomerărivăzute pe un frotiu, este încă estimat de obicei ca fiind normal (sau poate fi ocazional crescut.)
Trombocitopenia, pe de altă parte, poate fi o provocare în laboratorul de hematologie. În cazul trombocitopeniei, medicii au nevoie de un număr precis pentru a diagnostica, trata sau monitoriza pacienții. Chiar și o mică creștere sau scădere poate fi semnificativă atunci când există o trombocitopenie severă. Cu mai puține trombocite, fiecare trombocite contează!
Una dintre primele întrebări pe care trebuie să le punem la o trombocitopenie aparentă este dacă aceasta este o trombocitopenie adevărată sau dacă este o pseudotrombocitopenie(PTCP). O trombocitopenie adevărată reprezintă un pacient cu un număr scăzut de trombocite care poate necesita monitorizare sau intervenție medicală. Poate fi periculos să fie falsă trombocitopenia, dar este de asemenea periculos să se raporteze un număr scăzut de trombocite la un pacient cu o trombocitopenie falsă care nu este de fapt trombocitopenic. Pseudotrombocitopenia,sau trombocitopenia falsă, este definită ca un număr de trombocite scăzut în mod artificial sau eronat. În PTCP, numărul scăzut de trombocite se datorează unor aglomerări care sunt numărate ca 1 trombocite. (Aceste aglomerări mari pot fi, de asemenea, numărate ca WBC, dând astfel un număr fals crescut de WBC).
Potem împărți PTCP în 2 categorii Clumpingul de trombocite este cel mai frecvent cauzat de erori preanalitice, cum ar fi tuburile EDTA prea pline sau prea puțin pline, probe coagulate sau o întârziere de timp între recoltarea probei și testare. Tehnicienii ar trebui să verifice tubul pentru cheaguri și volumul probei și să facă o verificare delta pentru a ajuta la diferențierea trombocitopeniei și PTCP. Dar, în cazul unei probe aparent „bune”, următorul pas ar fi o analiză a frotiului. Dacă pe frotiu se văd cocoloașe, atunci trebuie să decidem ce a cauzat aceste cocoloașe. Este vorba de prima categorie, una dintre aceste probleme preanalitice comune, sau este vorba de a doua categorie de PTCP, o aglutinare in vitro a trombocitelor? Condițiile care pot cauza această aglutinare in vitro a trombocitelor includ aglutininele reci, mielomul multiplu, infecțiile, anticorpii anticardiolipină, nivelurile ridicate de imunoglobulină, terapia cu abciximab și pseudotrombocitopenia indusă de EDTA. (EDTA-PTCP) Dintre acestea, pseudotrombocitopenia indusă de EDTA este cea mai frecventă cauză. (Nakashima,2016).
Când tehnicienii vorbesc despre problemele legate de aglomerările de trombocite, de obicei este pentru că suntem în căutarea unor modalități de a rezolva sau de a estima cu exactitate numărul de trombocite din aceste probe, și nu pare să existe un răspuns ușor. aglomerarea face imposibilă o numărare precisă și chiar și estimările pot fi foarte dificile. Cum putem estima aceste cifre? Trebuie pur și simplu să raportăm prezența aglomerării cu „pare normal”, „scăzut” sau „crescut”? Sau ar trebui să împărțim estimările noastre în mai multe intervale pentru a le oferi medicilor informații mai valoroase?Și ce se întâmplă dacă furnizorul dorește un număr real pentru a oferi pacientului cea mai bună îngrijire posibilă și nu putem rezolva problema aglomerării? Ce putem face pentru a oferi o numărătoare? Printre primii pași recomandați se numără vortexarea probei timp de 2 minute pentru a sparge aglomerările de trombocite, apoi reanalizarea. Încălzireaamestecurilor poate ajuta, de asemenea, la rezolvarea aglomerărilor de trombocite, în special în cazul probelor cu aglutinine reci sau care au avut o întârziere în testare și au fost transportate sau depozitate la temperatura camerei sau mai mică. În cazul în care aglomerările persistă și recoltarea probei continuă să producă aglomerări de trombocite, atunci eroarea preanalitică poate fi exclusă și se poate suspecta o pseudotrombocitopenie indusă de EDTA. Multe laboratoare vor face ca un alt tub să fie prelevat sau vor folosi o altă metodă pentru a ajuta la rezolvarea aglomerării.
Atunci, ce este trombocitopenia indusă de EDTA (EDTA-PTCP)? Aceasta nu este reprezentativă pentru un anumit tablou clinic și nu este diagnostică pentru nicio afecțiune sau terapie medicamentoasă, ci este un fenomen de laborator datorat prezenței autoanticorpilor IgM/IgG dependenți de EDTA. acești anticorpi se leagă de glicoproteinele membranei plachetare în prezența EDTA. EDTA induce și îmbunătățește această legare prin expunerea acestor glicoproteine la anticorpi (Geok Chin Tan, 2016).(Geok Chin Tan, 2016) Deși este un fenomen in vitro, pacienții cu anumite afecțiuni, cum ar fi neoplasmele maligne, bolile hepatice cronice, infecțiile, sarcina și bolile autoimune, prezintă un risc crescut de EDTA-PTCP. Cu toate acestea, EDTA-PTCP a fost observată, de asemenea, la pacienții care nu suferă de boli. (Zhang, 2018)
Care sunt unele metode alternative pentru a ajuta la rezolvarea provocărilor legate de aglomerarea plachetară indusă de EDTA? Probabil cea mai comună este de a redesena probaîntr-un tub cu citrat de Na. Trebuie prelevate atât tuburi cu EDTA, cât și tuburi cu Na Citrat. Într-un adevărat EDTA-PTCP, așa cum s-a văzut în studiul nostru de caz, ar trebui să vedeți aglomerări pe frotiul realizat din tubul cu EDTA și nu ar trebui să vedeți aglomerări pe frotiul realizat din tubul cu Na Citrat. Din cauza volumului de anticoagulant din tubul de citrat de Na Citrate, trebuie să aplicați factorul de diluție de 1,1 la numărarea din tubul de Citrat de Na pentru a obține un număr exact de trombocite. Rețineți, totuși, că analizoarele de hematologie sunt aprobate și validate de FDA pentru utilizarea cu tuburi EDTA. Dacă doriți să utilizați un alt anticoagulant, metoda trebuie să fie validată în laboratorul dumneavoastră. Rețineți, de asemenea, că metodele alternative vor rezolva, în general, numai EDTA -PTCP, și nu și aglomerarea datorată altor aglutinine reci, medicamente sau tulburări. În plus, trombocitopenia indusă de anticoagulant nu se limitează la EDTA. Aceasta poate apărea, de asemenea, cu citrat și heparină. Într-un studiu, s-a constatat că până la 17% dintre pacienții cu un EDTA -PTCPal prezintă acest fenomen și cu citrat. De fapt, cercetătorii au constatat, și noi am constatat în propriile noastre validări, că unele probe care nu se aglomerează în EDTA se aglomerează în citrat de Na. Astfel, este posibil ca tuburile alternative să nu rezolve toate aglomerările de trombocite. (Geok Chin Tan, 2016)
Câteva laboratoare au validat tuburi anticoagulante ACD (acid citric, citrat trisodic, dextroză) pentru EDTA-PTCP. Folosind această metodă, tubul EDTA și ACD trebuie să fie rulate în paralel și trebuie aplicat un factor de conversie, reflectând diferența de diluție a probei în cele 2 tuburi. Pentru a face această comparație trebuie ales un parametru, cum ar fi RBC. Folosind o formulă care împarte RBC în EDTA la RBC în ACD se obține un raport care reflectă diferențele de diluție dintre anticoagulanți. Acest raport poate fi apoi înmulțit cu numărul de trombocite din ACD pentru a obține numărul de trombocite corectat cu ACD. (CAP Today, 2014). Unele surse au recomandat tuburile ACD deoarece incidența aglomerării cu NaCitrat poate fi frustrant de mare. Este teoretizat faptul că tubul ACD, mai acid, poate preveni aglomerarea trombocitelor mai bine decât Na Citrat. (Manthorpe, 1981)
Cele mai puțin utilizate sunt tuburile CTAD (citrat trisodic, teofilină, adenozină, dipiridamol) și heparina. CTAD acționează direct asupra trombocitelor și inhibă factorul plachetar 4, minimizând astfel activarea plachetară. Dezavantajele tuburilor CTAD sunt că acestea sunt sensibile la lumină și trebuie depozitate la întuneric,și pot fi costisitoare. Acestea modifică, de asemenea, raportul de diluție sânge/additiv, astfel încât trebuie să fie utilizate recalculări, așa cum s-a văzut în cazul citratului de Na și al ACD. Tuburile cu heparină sunt mai rar considerate benefice în rezolvarea problemelor de aglomerare a trombocitelorpentru că heparina poate activa trombocitele. Tuburile de heparină sunt, de asemenea, mai scumpe, așa că nu au fost, în general, o primă alegere pentru EDTA-PTCP.
Am auzit de la tehnicieni că laboratoarele lor au rezultate foarte bune folosind amikacina adăugată la tuburile EDTA pentru a preveni un număr fals de trombocite scăzute la pacienții cu EDTA-PTCP. Amikacina trebuie adăugată în tubul EDTA în termen de 1 oră după prelevare, iar testarea este stabilă timp de până la 4 ore la temperatura camerei. Rezultatele unui studiu realizat în 2011 au arătat că adăugarea de amikacină în tubul EDTA a produs o disociere rapidă a aglomerărilor de trombocite, cu un efect redus sau inexistent asupra morfologiei sau indicilor. Această metodă s-a dovedit a fi foarte promițătoare pentru raportarea exactă a numărului de trombocite la pacienții cu PTCP indusă de multivitaminoagulante. (Zhou, 2011)
Ultimul tub anticoagulant pe care l-am văzut menționat de mulți tehnicieni din grupul de interes în hematologie sunt tuburile Sarstedt ThromboExact. Am văzut multe mesaje de la tehnicieni care le folosesc și se pare că au o rată de succes foarte bună. Tuburile ThromboExact conțin săruri de magneziu și sunt special concepute pentru a determina numărul de trombocite în cazurile de PTCP. În prezent, acestea sunt validate doar pentru numărarea trombocitelor, iar probele sunt stabile timp de 12 ore după recoltare.Interesant este faptul că, înainte de analizoarele automate de hematologie, magneziul era anticoagulantul preferat pentru numărarea manuală a trombocitelor. EDTA-PTCP a fost recunoscută de la introducerea numărătorii automate de trombocite EDTA în anii 1970. Un studiu realizat în 2013 în Germania a utilizat tuburi ThromboExact cu rezultate excelente pentru rezolvarea PTCP indusă de multianticoagulante. Aceste tuburi au devenit disponibile pe piață în timpul studiului, în 2013. (Schuff-Werner, 2013) Din păcate pentru noiîn Statele Unite, aceste tuburi nu sunt disponibile în SUA. Am fost recent la o conferință și m-am dus la reprezentanții Sarstedt și am întrebat despre aceste tuburi. Mi s-a spus că acestea sunt disponibile în unele părți ale Europei și Asiei, dar nu sunt aprobate de FDA în SUA. Am întrebat cu multă speranță dacă au în vedere obținerea aprobării FDA și, din păcate, mi s-a spus că „nu cred că au piața necesară pentru a obține aprobarea.”
Care dintre metodele alternative pe care laboratorul dumneavoastră alege să le folosească, se recomandă să trageți un tub EDTA și tubul alternativ împreună. În acest fel pot fi comparate cele 2 numărători și prezența sau absența aglomerării în tuburi. Avem mulți pacienți care au avut o incidență de aglomerare, dar atunci când furnizorul comandă o numărătoare de trombocite cu Citrat de Na, obținem o nouă prelevare a tuburilor EDTA și Citrat de Na împreună, și nu există nici un semn sau aglomerare observată cu EDTA. În aceste cazuri, este adecvat să rezulte rezultatele EDTA, deoarece nu există nicio dovadă de EDTA-PTCP.
În cazul în care un pacient are un număr scăzut de PLT fără nicio boală hematologică, istoric familial și/sau tendință de sângerare identificată, iar erorile preanalitice au fost excluse, trebuie luată în considerare PTCP. Acest lucru nu înseamnă că un pacient cu PTCP va avea un număr normal de trombocite după ce aglomerarea este rezolvată. După cum s-a spus mai sus, mulți pacienți cu EDTA-PTCP au tulburări hematologice sau de altă natură și pot fi cu adevărat trombocitopenici. Rezolvarea aglomerării la acești pacienți ne permite să oferim furnizorului un număr precis de trombocite, ceea ce este foarte important la pacienții trombocitopenici.
Graficul de flux de mai jos (figura 4) arată câteva lucruri de luat în considerare atunci când se tratează aglomerarea plachetară. Scopul nostru este să rezolvăm clumpingul astfel încât să putem raporta un număr exact de trombocite în timp util. În laboratorul în care lucrez, am validat tuburile cu citrat de Na, dar acestea par să rezolve aglomerarea la mai puțin de 50% dintre pacienți. În ultimă instanță, pentru a obține o numărătoare exactă a trombocitelor, unele articole au sugerat să se colecteze un bețișor și să se efectueze numărători manuale. Am inclus acest lucru în fișă ca o opțiune pentru PTCP, însă, din cauza dificultății de a recolta o mostră de marfă și a subiectivității numărătorii, precum și a problemelor asociate cu calculele necesare, patologii noștri au decis că nu vom efectua numărătoarea manuală a trombocitelor. Din acest motiv, sunt implicat în prezent în monitorizarea clumpingului plachetar și voi efectua un mic studiu intern pentru a compara în paralel tuburileACD, CTAD și Na Citrate. În funcție de aceste rezultate, este posibil să testăm și amikacina. Dacă vom ajunge la vreo concluzie luminată, voi scrie un alt blog scurt cu rezultatele noastre!
Mulțumesc din nou lui Abu Jad Caesar, manager de laborator la Medicare Laboratories – filiala Tulkarm, în Palestina, care mi-a furnizat acest caz perfect de manual de PCTP, care a fost ușor de rezolvat prin colectarea în Na Citrat. Ne-am dori ca toți să citească manualele și să fie la fel de cooperanți!
- CAPToday, ianuarie 2014. accesat online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: În: In: Kottke-Marhchant K, ed.: Kottke-Marhchant K, Ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, a 2-a ediție. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudotrombocitopenia datorată aglomerării trombocitelor: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology (Rapoarte de caz în hematologie). Volumul 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Spurious Thrombocytopenia in AutomatedPlatelet Count. Laboratory Medicine 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacin can be added to blood to reduce the fall in platelet count. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM a absolvit Merrimack College din N. Andover, Massachusetts, cu o diplomă de licență în tehnologie medicală și a obținut un master în științe de laborator clinic la Universitatea din Massachusetts, Lowell. Ea a lucrat ca tehnolog medic timp de peste 30 de ani. A lucrat în toate domeniile laboratorului clinic, dar are un interes deosebit pentru Hematologie și Banca de sânge. Când nu este ocupată să fie un om de știință nebun, poate fi găsită afară mergând pe bicicletă.