Sinergia funcțională pozitivă a dimerilor proteici artificiali integrați structural asamblați prin chimia Click

Locuri de interfață ale chimiei Click

Am presupus că zonele de pe suprafața unei proteine care sunt compatibile din punct de vedere al asocierii au mai multe șanse de a genera o structură integrată prin formarea de interacțiuni necovalente compatibile între ele. Deoarece proteinele sunt monomerice, aceste interacțiuni sunt, în cel mai bun caz, slabe și tranzitorii, deci nu vor persista, am considerat că avem nevoie de un „șurub” molecular ca parte a situsului de interfață pentru a promova și a stabiliza orice noi interacțiuni. Primul pas este acela de a identifica regiunile de pe proteinele țintă care au potențialul inerent de a interacționa. ClusPro 2.040 (cluspro.org) a fost utilizat pentru a genera configurații potențiale de dimeri. Modelele de homodimer sfGFP de ieșire au fost rafinate, analizate și clasificate cu ajutorul RosettaDock41,42 (tabelul suplimentar 1). Configurația cel mai bine clasată este prezentată în Fig. 1b (care este cel mai apropiat model de structura determinată de mai jos; vide infra), iar următoarele 4 configurații clasate sunt prezentate în Fig. suplimentară 1. În timp ce au fost observate orientări diferite ale unui sfGFP față de celălalt, docking-ul a relevat că reziduurile 145-148, 202-207 și 221-224 au fost găsite în mod obișnuit pentru a contribui la interfața dimeră. Pentru a îmbina cele două proteine, a fost utilizată chimia Click bioorthgonal codificată genetic (Fig. 1a). Beneficiile în comparație cu, de exemplu, legăturile disulfidice includ lanțuri laterale mai lungi pentru a depăși eventualele ciocniri sterice, o stabilitate îmbunătățită a legăturii încrucișate și capacitatea de a genera heterodimeri nesimetrici (reziduuri de legătură diferite pe monomeri diferiți) și heterodimeri într-o manieră proiectată 1 la 1 (vide infra).

Pe baza modelelor de dimeri, au fost selectate trei reziduuri pentru a fi înlocuite cu cele două ncAA compatibile cu Click, SCO43 (alchină încordată) și azF (azidă)44,45 (Fig. 1a). H148 și Q204 au fost alese pe baza localizării lor la interfața putativă a dimerului (Fig. 1b și Fig. suplimentară 1). Se știe că ambele reziduuri sunt ușor de modificat cu adaosuri de ciclooctilenă de moleculă mică la încorporarea azF34,46 și se află aproape de centrul funcțional, cromoforul sfGFP (CRO) (Fig. 1b). Analiza deplasării mobilității pe gel a arătat că dimerizarea a fost un succes (Fig. 1c, d); acest lucru a fost confirmat prin analiza prin spectrometrie de masă (Fig. suplimentară 2). Reziduul 132 nu a fost prezis să se afle la interfața dimerului (Fig. 1b și Suplimentar 1), dar este cunoscut ca fiind compatibil cu o serie de aduși alchene tensionați, de la coloranți46 la nanotuburi de carbon35 și ADN monocatenar36. Astfel, aceasta acționează ca un bun test al capacității noastre de a prezice interfețele proteină-proteină și compatibilitatea reacției Click. În ciuda faptului că reziduul 132 este expus la suprafață, nu s-a observat niciun produs de dimer folosind sfGFP132azF cu proteina care conține SCO (Fig. suplimentară 3), ceea ce indică importanța compatibilității interfeței de suprafață și utilitatea analizei in silico pentru a ajuta la identificarea situsurilor compatibile cu chimia clic. Fie ciocnirile sterice și/sau interacțiunile proteină-proteină care persistă mai mult timp în alte regiuni pot împiedica reticulația covalentă la reziduul 132.

Schimbare funcțională pozitivă la formarea dimerului sfGFP148x2

H148 formează o legătură H cu CRO (Fig. 1b) și joacă un rol important în naveta de protoni care reglează populația formei neutre A (λmax ~ 400 nm, CRO A) și a formei anionice B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 prezente în starea fundamentală. Forma B predomină în sfGFP, dar la încorporarea azF în locul lui H148 (sfGFP148azF), eliminarea legăturii H duce la predominarea stării A33,34 (Fig. 2a și tabelul 1). Încorporarea SCO la reziduul 148 (sfGFP148SCO) determină un efect similar, cu CRO A predominând, dar cu o deplasare spre roșu mai mică (λmax 492 nm) în forma minoră CRO B (Fig. 2a și Tabelul 1).

Dimerizarea sfGFP148azF și sfGFP148SCO produce două efecte pozitive semnificative: (i) comută fluorescența ON la ~490 nm datorită promovării formei CRO B; (ii) luminozitate mult îmbunătățită prin creșterea coeficientului de absorbție molară la 490 nm (Fig. 2a și tabelul 1). Picul principal de excitație este deplasat spre roșu la dimerizare (λmax 492 nm) în comparație cu sfGFPWT (λmax 485 nm) (tabelul suplimentar 3). Raportul de absorbție 490:400 nm se modifică cu un ordin de mărime de la ~0,5 pentru monomeri la ~5 pentru dimer, cu forma CRO B dominând spectrul de absorbție al dimerului (Fig. 2a), în ciuda absenței aparente a unei specii care poate înlocui rolul grupului imidazol H148. Exemplele anterioare de modificare a sfGFP148azF cu adaosuri de molecule mici sau fotoactivare au dus, în cel mai bun caz, la o conversie parțială în forma CRO B33,34. Schimbarea de 10 ori a absorbanței este reflectată în emisia de fluorescență; excitarea la 490 nm are ca rezultat o emisie de ~20 ori mai mare decât oricare dintre monomeri (Fig. 2a). În plus, dimerul prezintă o funcție îmbunătățită chiar și în comparație cu superfolderul original sfGFPWT (Fig. 2b și Tabelul 1). Absorbția molară și luminozitatea au crescut cu ~320% pentru sfGFP148x2 (~160% pe bază de CRO) (Fig. 2b) mai mare decât se așteaptă pentru o simplă creștere aditivă dacă unitățile monomerice acționează independent una de cealaltă.

Pentru a investiga importanța legăturii biortogonale am construit o legătură clasică bazată pe disulfură prin mutarea lui H148 în cisteină. Variantele sfGFPH148C au dimerizat, dar numai în prezența Cu2+ (Fig. suplimentară 4). Proprietățile spectrale au sugerat că dimerul a fost mai puțin fluorescent în comparație cu sfGFP148x2 și sfGFPWT (Fig. Suplimentară 4). Monomerul sfGFPH148C a prezentat trecerea așteptată de la CRO B la CRO A. Deși s-a observat o trecere de la CRO A la CRO B la dimerizarea sfGFPH148C, dimerul a avut o absorbție molară per CRO mai mică decât sfGFPWT și semnificativ mai mică decât sfGFP148x2; s-a observat încă o populație semnificativă a stării A. Emisia de fluorescență la excitarea la 490 nm pentru sfGFPH148C dimeric a fost aproximativ jumătate din cea a sfGFPWT. Astfel, abordarea biortogonală a generat o specie dimerică mai performantă decât legarea clasică prin legături disulfidice.

Baza moleculară pentru comutarea funcțională în sfGFP148x2

Structura cristalină a sfGFP148x2 (a se vedea tabelul suplimentar 2 pentru statistici) arată că monomerii formează o interfață dimerică extinsă cu interacțiuni cu rază lungă de acțiune care leagă cei doi centre CRO. Unitățile monomerice ale sfGFP148x2 se dispun într-un aranjament cvasi-simetric cap-coadă decalat cu ~45° unul față de celălalt (Fig. 3a). Aranjamentul antiparalel al monomerilor unul lângă altul este cel mai apropiat de cel al modelului cel mai bine clasat (Fig. suplimentară 1 și Tabelul suplimentar 1). Densitatea electronică a noii legături încrucișate de triazol este clar definită (Fig. 3b) și formează legătura anti-1,4-triazol alungită care este parțial îngropată și intim asociată cu ambele unități monomerice, formând astfel o parte integrantă a interfeței dimerului (Fig. 3c). CRO-urile sunt la o distanță de 15 Å îndreptate una spre cealaltă (Fig. 3a).

Interfața are caracteristici similare cu cele ale dimerilor naturali48. Suprafața îngropată a interfeței este de ~1300 Å2, la care contribuie, în general, aceleași reziduuri din fiecare monomer (Fig. 3c, d). Legătura H joacă un rol important, reziduurile E142, N146, S147, N149 și N170 din ambii monomeri contribuind la opt legături H inter-subunități (Fig. 3b). Structura arată că interfețele dimerice naturale pot fi imitate și stabilizate prin utilizarea monomerilor legați de Click, pe care modelarea inițială a sugerat că sunt fezabile, dar care erau probabil prea slabe sau tranzitorii pentru a persista fără legătura încorporată. Astfel, s-ar putea ca abordarea noastră să poată fi utilizată pentru a stabiliza interacțiuni proteice-proteice slabe tranzitorii mai largi, formând astfel interfețe definite.

Dimerizarea induce o serie de modificări conformaționale pentru a forma o rețea de interacțiune cu rază lungă de acțiune care stă la baza mecanismului prin care sfGFP este activată și luminozitatea este îmbunătățită. Structura sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 arată că 148azF ocupă o poziție similară cu H148 în sfGFPWT, dar nu poate de la legătura H critică cu grupul OH al fenolului CRO care promovează formarea stării B a CRO. La dimerizare, modificarea lui 148azF prin formarea legăturii de triazol cu 148SCO în monomerul cognat are ca rezultat o schimbare atât în coloana sa vertebrală, cât și în poziția lanțului lateral, cauzând o gaură care poate fi acum ocupată de o moleculă de apă în dimer (W1azF în Fig. 4a). Apa poate realiza o legătură H cu CROazF și cu carbonilul din coloana vertebrală a 148azF (Fig. 4). O apă echivalentă este prezentă în unitatea monomerică sfGFP148SCO, (W1SCO) care formează interacțiuni similare. Aceste molecule de apă structurate au potențialul de a înlocui interacțiunea de legătură H pierdută la eliminarea lui H148, activând astfel dimerul prin promovarea formării CRO B în starea fundamentală. Moleculele de apă sunt, de asemenea, îngropate la interfața dimerului, astfel încât schimbul dinamic cu solventul de bază va fi mult redus. În plus, cele două CRO sunt acum legate printr-o rețea extinsă predominant de apă care se întinde pe interfața dimerului (Fig. 4b, c). Analiza compoziției tunelului a arătat că trei molecule de apă din fiecare unitate (W1azF/SCO, W2azF/SCO și W3azF/SCO) sunt simetrice; W4 combinată cu coloana vertebrală a F145SCO asigură puntea peste interfața dimerului pentru a lega cele două rețele de apă. Astfel, dimerizarea generează o rețea extinsă de legături H bogată în apă între monomeri, favorizând astfel trecerea de la starea A CRO la forma B.

Analiză de fluorescență cu o singură moleculă a sfGFP148x2

Microscopia de fluorescență cu reflexie internă totală (TIRF) a fost utilizată pentru a investiga comportamentul fluorescent al dimerilor sfGFP148x2 la nivelul unei singure molecule. Evoluția în timp a intensității de fluorescență a dimerilor singuri sfGFP148x2 a demonstrat o gamă de stări de intensitate, cu o fluorescență la ~80-100 de numere predominând și prezentând o longevitate mai mare decât subpopulația de stări de intensitate mai mare, acestea fiind caracterizate de scurte incursiuni la o gamă de intensități de la ~100 la 300 de numere (Fig. 2c). Urmele de fluorescență demonstrează, de asemenea, o fotostabilitate prelungită, cu perioade lungi până la fotobelificare (Fig. 2c și Fig. suplimentară 5). În comparație, sfGFPWT se fotodepășește mai rapid, cu urme de fluorescență care prezintă o singură stare de intensitate în care stările de activare durează, în general, perioade mai scurte (Fig. Suplimentară 6). Mai mult, s-a constatat uneori că sfGFPWT monomeric există într-o stare inițială întunecată, non-fluorescentă, înainte de inițierea fluorescenței și de fotoblematizarea ulterioară (Fig. Suplimentară 6). Extragerea timpului mediu consecutiv de fluorescență „în funcțiune” înainte de fotodecolorare și de ocupare a stărilor nefluorescente tranzitorii (clipire) arată că sfGFP148x2 prezintă perioade mai lungi de fluorescență continuă (medie de 0,9 s), comparativ cu sfGFPWT (0,65 s). Având în vedere similitudinea în intensitatea fluorescenței măsurate la nivelul unei singure molecule, timpii ON crescuți și durata de viață a fotoblanșării contribuie probabil la creșterea fluorescenței observate în măsurătorile ansamblului în stare stabilă a sfGFP148x2 (Fig. 2a).

În încercarea de a raționaliza gama de stări de fluorescență observate în urmele dimerilor, a fost generată o histogramă a tuturor intensităților măsurate (Fig. 2c). Spre deosebire de sfGFPWT (Fig. Suplimentară 6) care prezintă o singură distribuție log-normală49, sfGFP148x2 a favorizat o potrivire cu două componente50 (Fig. 2c). Distribuția intensității măsurate prezintă un vârf predominant de intensitate mai mică (~90 de numere) și un vârf de intensitate mai mare care se suprapune parțial, ca o consecință a scurtelor incursiuni în stări de intensitate mai mare observate în urmele de fluorescență ale moleculei unice. În timp ce o distribuție bimodală a intensității ar putea fi așteptată în mod normal la un dimer format din doi fluorofori co-localizați și activi în mod independent, cu fiecare fluorofor care se fotodepășește în mod secvențial, urmele de timp ale intensității unei singure molecule nu sunt în concordanță cu acest model și arată o lipsă de două stări bine definite. Comportamentul simplu de activare/dezactivare al sfGFPWT este rareori observat în urmele de dimer care, la rândul lor, nu se prezintă ca un produs de adaos anticipat de două urme monomere, ci prezintă un comportament mai complex.

Funcție sporită la formarea dimerului sfGFP204x2

Pentru a explora modul în care diferite situsuri de legătură pot determina efecte funcționale, am investigat dimerul alternativ sfGFP204x2 (Fig. 5a) construit mai sus (Fig. 1d). Am constatat că dimerizarea a îmbunătățit proprietățile spectrale peste cele ale simplei adăugări a proteinelor monomerice sau sfGFPWT, subliniind din nou beneficiile sinergice ale dimerizării. Încorporarea fie a azF, fie a SCO la reziduul 204 a avut un efect redus asupra proprietăților spectrale în comparație cu sfGFPWT 46 (Fig. 5b și Tabelul 1). Forma B CRO a predominat în formele monomerice; atât absorbția molară, cât și intensitățile de emisie au fost similare între ele și cu sfGFPWT. Emisia de fluorescență a sfGFP204SCO a fost ușor redusă (80 % din sfGFPWT; tabelul 1). La formarea dimerului sfGFP204x2 (a se vedea Fig. 1d și Fig. Suplimentară 2 pentru dovezi), analiza spectrală a arătat o îmbunătățire funcțională în ceea ce privește parametrii spectrali de bază: coeficientul de absorbție molară (ε) și emisia de fluorescență (Fig. 5b și Tabelul 1). La dimerizare, ε a crescut cu până la 400% în comparație cu monomerii de pornire, ajungând la 160.000 M-1 cm-1 . Acest lucru echivalează cu o absorbanță molară medie per CRO de 80.000 M-1 cm-1, aproape dublând luminozitatea în comparație cu monomerii de plecare și cu 31.000 M-1 cm-1 mai mare în comparație cu sfGFPWT. În concordanță cu creșterea capacității de absorbție a luminii, emisia de fluorescență a fost, de asemenea, îmbunătățită; emisia normalizată per CRO a fost cu 180% mai mare decât cea a monomerului sfGFP204azF. Utilizând calculul Strickler-Berg51 (site-ul web huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/), timpii de viață ai fluorescenței scad de la 3,2 ns pentru sfGFPWT la 0,92 ns pentru sfGFP204x2. Astfel, ca și în cazul sfGFP148x2, structura dimerică a sfGFP204x2 are o probabilitate crescută de excitare electronică și emisie de fluorescență în comparație cu formele monomerice (a se vedea figura suplimentară 8 pentru comparația spectrală a dimerilor). Acest lucru este cu atât mai impresionant pentru ambele forme dimerice cu cât sfGFPWT este un punct de referință pentru performanța proteinei fluorescente verzi.

Importanța simetriei pentru sinergie

Homodimerii proteici naturali sunt în general simetrici1,52 și o astfel de simetrie a fost mimată în dimerul nostru artificial printr-un reziduu comun de reticulare. Am investigat importanța unui reziduu comun de legătură încrucișată (ca o imitație a simetriei structurale) pentru sinergia funcțională. Avantajul chimiei biortogonale constă în faptul că mânerele de reacție reciproc compatibile permit construirea unor perechi definite (de exemplu, 148 + 204 = 148-204 și nu 148-148 sau 204-204), împiedicând astfel formarea unor produse nedorite care vor fi dificil de separat.

Au fost generați dimeri care au legat reziduurile 148 și 204 în cele două combinații disponibile (148SCO+204azF și 148azF+204SOC). Fluorescența în stare stabilă a arătat că în ambele forme dimerice, formele protonate și deprotonate ale CRO erau clar prezente (Fig. 6a, b). Dimerul legat 148azF-204SCO a prezentat o modificare a populațiilor relative ale formelor A și B, cu o creștere semnificativă a coeficientului de absorbție molară la 490 nm (Fig. 6a); acesta a fost aproape dublu față de cel original sfGFP204SCO și cu ~30% mai mare decât cel prezis prin simpla adăugare a spectrelor monomerilor. Înălțimea relativă a vârfului de 400 nm rămâne similară atât în dimerul legat sfGFP148azF, cât și în dimerul legat 148azF-204SCO, sugerând că populația formei deprotonate este similară în dimer ca și în monomerul original. Dimerizarea prin intermediul combinației 148SCO-204azF a modificat populațiile relative ale formelor protonate și deprotonate, dar reducerea vârfului de absorbție de 400 nm nu a fost însoțită de o creștere concomitentă a vârfului de 490 nm (Fig. 6b). De fapt, dimerizarea a fost în mare măsură dăunătoare, deoarece ambele vârfuri majore de absorbție au avut un coeficient de absorbție molară mai mic decât în cazul spectrelor de simplă adiție a monomerilor (Fig. 6b). Este clar că dimerii legați asimetric sunt mai puțin fluorescenți și conțin o populație mixtă semnificativă a celor două stări CRO în comparație cu dimerii legați simetric, astfel încât, în acest caz, simetria are implicații funcționale importante.

Heterodimerii și integrarea funcțională

Heterodimerii, în care un dimer este compus din două proteine diferite, reprezintă o stare de dimerizare alternativă frecvent observată1,2. Aceasta ne permite, de asemenea, să proiectăm noi complexe în care pot fi legate proteine distincte din punct de vedere funcțional. Avantajul cuplării bioortogonale este capacitatea de a genera (hetero)dimeri (hetero)definiți, de o singură specie, compuși din două unități proteice diferite (de exemplu, A + B = A-B și nu A-A, B-B, amestec A-B care poate fi dificil de separat). Proteina fluorescentă galbenă Venus29 a fost aleasă ca proteină parteneră a sfGFP, având în vedere suprapunerea spectrală dintre cele două (figura suplimentară 9). Diferențele de secvență sunt prezentate în Fig. suplimentară 10.

SfGFP148SCO a fost combinată cu Venus echivalentă care conține azF (Venus148azF) pentru a genera GFVen148 (a se vedea Fig. suplimentară 11 pentru dovezi). Apar noi caracteristici spectrale care sugerează că a fost generat un sistem integrat. Formarea GFVen148 generează un dimer care prezintă o luminozitate îmbunătățită în comparație fie cu sfGFP148SCO, fie cu Venus148azF (Fig. 7a și tabelul suplimentar 3). Este interesant faptul că dimerul are proprietăți spectrale intermediare față de monomerii individuali, fără o lărgire semnificativă a vârfurilor (Fig. 7a, b și Fig. suplimentară 12a), ceea ce sugerează că cei doi centre CRO au devenit integrați din punct de vedere funcțional în ceea ce privește emisia de fluorescență. λmax principal este de 505 nm, intermediar între sfGFP (492 nm) și Venus (517 nm). Valoarea ε echivalentă cu forma B CRO (regiunea 490-510 nm) crește semnificativ (~4-5 ori), mai mare decât spectrele aditive simple ale monomerilor, în timp ce populația A CRO scade, dar este încă observată (Fig. 7a). Acest lucru este egalat de o creștere de ~4 ori a intensității de emisie la excitarea la 505 nm (Fig. 7b). Se observă un singur vârf de emisie care este, de asemenea, intermediar între cei doi monomeri, indiferent de lungimea de undă de excitare (λEM la 517 nm; Fig. 7b, c); la excitarea la 490 nm (capabilă să excite ambele CRO) s-a observat un singur vârf, mai degrabă decât unul dublu sau lărgit, sugerând că emite o singură specie. Un spectru aditiv al spectrelor monomerilor individuali care simulează două proteine care acționează independent susține ideea unei noi funcții integrate, deoarece este mai larg și deplasat spre roșu în comparație cu profilul de emisie GFVen148x2 măsurat (Fig. suplimentară 12b). Emisia la excitarea la 400 nm a fost, de asemenea, măsurată, deoarece Venus148azF are o absorbție mică la această lungime de undă în comparație cu GFVen148. Intensitatea emisiei a fost de 30 de ori mai mare pentru GFVen148 în comparație cu Venus148azF monomeric, cu un vârf de emisie la 517 nm (Fig. 7c și Fig. suplimentară 12c). Mai degrabă decât să prezinte FRET clasic, așa cum ar fi fost de așteptat (vezi supra), GFVen148 pare să acționeze ca o singură entitate în ceea ce privește emisia de fluorescență. Acest lucru ar putea sugera că două CRO acționează acum predominant ca o singură specie, aspectele structurale observate pentru sfGFP148x2 (cum ar fi rețeaua de apă) jucând un rol. Prezența unei stări A neutre semnificative a CRO sugerează că cele două unități monomerice nu sunt complet sincronizate. Totuși, acest lucru nu anulează impactul clar pe care dimerizarea îl poate avea în generarea unor proprietăți spectrale noi, cum ar fi cele observate la GFVen148.

Ca și în cazul sfGFP, încorporarea azF în locul Q204 (denumită Venus204azF) a avut un efect redus asupra proprietăților spectrale ale lui Venus (tabelul suplimentar 3). Legătura covalentă prin 204 SPAAC (realizând GFVen204) a generat cu succes un dimer (Fig. Suplimentară 11). GFVen204 a combinat caracteristicile spectrale ale ambilor monomeri, generând o specie cu λMax atât la 490 cât și la 514 nm (raport de 1:1,2) (Fig. 7e, f și Tabelul suplimentar 3). Venus204 absoarbe, de asemenea, la 490 nm, dar la un raport de 1:2,7 față de 514 nm. Formarea de dimeri a sporit din nou absorbția molară peste cea a monomerilor individuali; în special ε a crescut cu ~26.000 M-1 cm-1 (~27%) pentru λmax asociat lui Venus (514 nm), unde există o contribuție mică pentru sfGFP. Pentru a investiga comunicarea dintre monomeri, a fost monitorizată emisia de fluorescență la excitare la patru lungimi de undă diferite: 400 nm (numai sfGFP); 450 nm (sfGFP, Venus minor); 490 nm (sfGFP λmax, Venus umăr); 510 (Venus, sfGFP minor). La toate lungimile de undă de excitație, singurul vârf de emisie clar a fost la 528 nm (Fig. 7b), care corespunde lui Venus indicând comunicarea prin transfer de energie de rezonanță Förster (FRET). Un vârf de emisie corelat cu sfGFP204SCO (~510 nm) nu a fost observat nici măcar la excitarea la lungimi de undă mai mici specifice pentru sfGFP. De asemenea, nu a fost observat nici vârful de emisie intermediar caracteristic pentru GFVen148, subliniind caracteristicile noi ale heterodimerului 148. Cea mai semnificativă diferență a fost observată la excitarea la 400 nm, unde există o creștere de 14 ori a intensității de emisie la 528 nm pentru GFVen204 în comparație cu Venus204azF (Fig. 7f, inset). Eficiența FRET relativă calculată după descompunerea spectrală a fost de aproximativ 90 %. Astfel, cei doi centri funcționali comunică prin transfer de energie (Fig. 7g) într-un mod foarte eficient.

.