Probleme inițialeEdit
TermolabilitateEdit
Aplicația inițială a recombinazei FLP-FRT nu a funcționat la mamifere. Proteina FLP era termolabilă (denaturată la temperaturi ridicate) și, prin urmare, nu a fost utilă în modelul mamiferelor din cauza temperaturilor corporale ridicate ale acestor sisteme model. Cu toate acestea, din cauza brevetelor și a restricțiilor privind utilizarea recombinării Cre-Lox, s-a manifestat un mare interes pentru a produce o casetă FLP-FRT mai termostabilă. Unele dintre primele rezultate au fost obținute de Buchholz et al. (1997) prin utilizarea mutagenezei ciclice în Escherichia coli . În cercetările lor, autorii au transfectat celule E. coli cu două plasmide: una care codifică proteine FLP mutate aleatoriu în aval de un promotor de arabinoză și alta care conține un promotor al genei lacZ în cadrul unei casete FRT. E. coli au fost cultivate pe plăci cu arabinoză la 37 °C și 40 °C, iar dacă avea loc o recombinare, expresia lacZ era atenuată, iar coloniile apăreau albe. Coloniile albe au fost selectate din fiecare generație și cultivate pe o nouă placă de arabinoză la aceleași temperaturi anterioare timp de opt generații. După confirmarea recombinării prin Western-blotting și secvențierea genelor FLP mutante, această a opta generație de proteină FLP (FLPe) a fost transfectată în culturi de celule de mamifere, iar recombinarea în celulele de mamifere a fost confirmată. Această variantă de FLP are doar 4 substituții de aminoacizi: P2S, L33S, Y108N și S294P.
Generarea de mozaicuri geneticeEdit
Mozaicismul genetic apare în cadrul unui organism atunci când tipuri de celule similare exprimă fenotipuri diferite din cauza unor genotipuri diferite la loci specifici. Pe scurt, acest lucru apare atunci când un organism conține genotipuri diferite, ceea ce este de obicei rar în natură. Cu toate acestea, acesta poate fi produs cu ușurință (și în mod problematic) cu ajutorul recombinării FLP-FRT. Dacă în cadrul unei celule sunt prezente două situsuri FRT diferite, iar FLP este prezent în concentrații adecvate, caseta FRT va continua să fie excizată și inserată între cele două situsuri FRT. Acest proces va continua până când proteinele FLP scad sub concentrațiile necesare, rezultând celule dintr-un organism care posedă genotipuri diferite. Acest lucru a fost observat de la muștele fructelor până la șoareci și nu face discriminare față de cromozomi specifici (somatici și sexuali) sau tipuri de celule (somatice și germinale).
Determinarea liniilor celulareEdit
Până la publicarea lui Dymecki și colab. (1998), recombinaza Cre a fost utilizată pentru cartografierea sorții celulare a progenitorilor neuronali la șoareci folosind promotorul En2. Astfel, autorii lucrării Dymecki et al. (1998) au teoretizat că recombinaza FLP ar putea fi utilizată într-un mod similar, cu o eficacitate similară cu cea a recombinazei Cre la șoareci. Autorii au creat două linii de șoareci transgenici: o linie de fuziune neuronală Wnt1::Flp și o linie care posedă caseta FRT care flanchează exonul 18 al tm1Cwr. Autorii au ales acest exon pentru excizie deoarece, dacă este excizat, are ca rezultat un fenotip nul. Autorii au împerecheat cele două linii și au permis progeniturilor să ajungă la vârsta adultă înainte ca acestea să fie sacrificate. Extracția de ARN a fost efectuată pe țesut neuronal, muscular, enteric și de coadă. PCR de transcriere inversă și Northern blotting au confirmat excizia celui de-al 18-lea exon al tm1Cwr în mod abundent în țesutul cerebral și moderat în țesutul muscular (datorită celulelor Scwhann din mușchi). După cum era de așteptat, excizia nu a fost observată în alte țesuturi. Autorii au observat o eficiență egală, dacă nu chiar mai bună, a recombinazei FLP în determinarea destinului celular decât recombinaza Cre.
La Drosophila melanogaster (Musca fructelor)Edit
Până în prezent, recombinaza Flp a fost utilizată de multe ori la D. melanogaster. O comparație a recombinazei Flp cu recombinaza Cre în D. melanogaster a fost publicată de Frickenhaus et al. (2015). Autorii lucrării Frickenhaus et al. (2015) au avut un dublu obiectiv: să caracterizeze și să compare eficacitatea recombinazei Flp „knock-out” cu cea a recombinazei Cre „knock-out” și a knock-down-ului RNAi și să dezvăluie funcția cabeza (caz), ortologul muștelor pentru FUS, în neuronii și țesutul muscular al D. melanogaster. FUS a fost puternic implicată în scleroza laterală amiotrofică (ALS) și în demența frontotemporală la om. Autorii au folosit un sistem elav-Gal4/UAS-Flp sau Cre pentru a exprima recombinaza în mod specific în neuroni și un sistem Mef2-Gal4/UAS-Flp sau Cre pentru a o exprima în mod specific în mușchi. Autorii concluzionează că instrumentul de „knock-out” al recombinazei Flp este mai eficient decât atât RNAi, cât și recombinaza Cre, în scopul eliminării unor gene specifice în anumite țesuturi sau linii celulare, datorită lipsei de exprimare dispersată observată atât la proteina Cre, cât și la transcriptul RNAi. De asemenea, autorii au observat o toxicitate a proteinei Cre care nu este observată în cazul proteinei Flp.
La Danio rerio (pește zebră)Edit
Eficacitatea sistemului de recombinație FLPe a fost evaluată la peștele zebră de către Wong et al. (2009). Embrionii, care au fost hemizigoți pentru o proteină fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP) flancată de FRT în aval de un promotor specific mușchilor, au fost injectați cu proteina FLPe. Fără FLPe, acești embrioni ar trebui să exprime EGFP în toate țesuturile musculare, iar dacă sunt încrucișați cu un filon de tip sălbatic, 50 % din progenitura rezultată ar trebui să exprime, de asemenea, EGFP în țesutul muscular. Embrionii injectați cu FLPe au avut o expresie semnificativ redusă a EGFP în țesutul muscular și s-a observat, de asemenea, mozaicism. Când acești embrioni au ajuns la vârsta adultă, au fost împerecheați cu o tulpină de tip sălbatic, iar clusterele rezultate au avut mult mai puțini descendenți care exprimau EGFP în țesutul muscular (0-4%). Aceste rezultate arată că FLPe nu numai că este foarte eficient în celulele somatice, dar este foarte eficient și în linia germinală a peștilor zebră,
În planteEdit
Crearea de „fitosenzori” sau „santinele” în Arabidopsis thaliana și tutunEdit
Fitosenzorii sunt plante modificate genetic care pot raporta prezența contaminanților biotici sau abiotici. În mod evident, producția acestor plante modificate genetic este foarte promițătoare în agricultură și în laborator. Cu toate acestea, crearea unui vector raportor adecvat s-a dovedit a fi problematică. elementele de reglementare cis joacă un rol major în activarea transcripțională a genelor în plante, iar multe dintre ele nu sunt bine cunoscute. Mulți fitosenzori fie își exprimă insuficient genele reporter, fie raportează rezultate fals-pozitive din cauza promotorilor sintetici. Autorii din Rao et al. (2010) au utilizat instrumentul de recombinație FLP pentru producerea unui fitosenzor foarte eficient. Autorii au utilizat un promotor de șoc termic pentru a induce producția de FLP, în timp ce un vector flancat de FRT a separat promotorul CaMV 35S de gena beta-glucuronidazei (GUS). Atunci când plantele au fost expuse la un șoc termic, inducerea FLP a dus la excizia vectorului flancat de FRT, mutând efectiv gena GUS direct în urma promotorului CaMV 35S. Activarea GUS a dus la schimbarea frunzelor plantelor de la verde la albastru; astfel, fitosenzorul a raportat în mod eficient stresul la sistemul model!
Cu Cre-recombinazaEdit
Producerea sistemului de exprimare a MiRNA-ului inductibil (GRIM) gate-way-ready inducible (GRIM)Edit
Interferența ARN-ului (ARNi) a provocat o schimbare de paradigmă în exprimarea genelor și a potențialelor gene knock-out la eucariote. Înainte de producerea sistemului de expresie GRIM, crearea vectorilor de ARNi era costisitoare și consumatoare de timp. Vectorii erau produși prin metoda tradițională de clonare moleculară copy-and-paste. Garwick-Coppens et al. (2011) au dezvoltat o metodă mult mai eficientă de producere a vectorilor RNAi, în care expresia RNAi poate fi eliminată cu ajutorul Cre-recombinazei și eliminată cu ajutorul Flp-recombinazei. Noul sistem de expresie GRIM permite generarea mult mai rapidă a vectorilor de expresie care conțin construcții artificiale de ARNi. Autorii au continuat să arate că sistemul lor de expresie funcționează destul de eficient în celulele de rinichi embrionar uman (HEK), o linie celulară umană imortalizată comună în cercetarea moleculară.
.