Probe FFPE – Pregătirea probelor de țesut uman – Lab-Ally

Tabelă de materii

Introducere |Achiziționarea țesuturilor | Prelucrarea țesuturilor FFPE |Secționare | Referințe

Dacă aveți nevoie de probe FFPE sau de alte probe biologice umane pentru cercetarea dumneavoastră, vă rugăm să ne contactați.

Introducere

Mulți dintre cercetătorii de astăzi preferă să utilizeze eșantioane FFPE de țesuturi pentru analizele lor IHC, histologice sau genomice in situ. FFPE înseamnă „Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” și descrie cele două caracteristici cheie ale acestei metode de conservare a țesuturilor. Formalina este o soluție de formaldehidă și a fost utilizată de la descoperirea, la sfârșitul anilor 1800, a efectelor conservante ale formaldehidei de către medicul german Ferdinand Blum (Fox, et al., 1985). Parafina este infuzată în țesut în urma fixării cu formaldehidă, iar țesutul este, de asemenea, înconjurat cu un înveliș de parafină pentru a ajuta la susținerea acestuia și a-l proteja de oxidare. Probele FFPE fixate și încorporate în mod profesionist și biomoleculele pe care le conțin sunt rezonabil de stabile la temperatura ambiantă. Din punct de vedere structural, țesuturile fixate și încorporate sunt rezistente și pot fi utilizate pentru studii de anatomie microscopică aproape pe termen nelimitat, dar, în timp, antigenitatea unor proteine se va degrada, limitând studiile IHC la eșantioane nu mai vechi de câteva decenii. ADN-ul bicatenar este surprinzător de stabil în blocurile FFPE, dar alte biomolecule mai puțin stabile, cum ar fi ARN-ul, se pot degrada în decurs de un deceniu sau mai puțin, în special după ce secțiunile au fost tăiate.

Arhivele care acumulează un număr mare de probe FFPE sunt o sursă deosebit de bogată de date atunci când se dorește compararea mai multor cazuri (adică probe FFPE de la mai mulți donatori) pentru a trage concluzii robuste din punct de vedere statistic cu privire la caracteristicile anumitor indicații. În cazul în care probele FFPE urmează să fie utilizate în cercetări biomedicale cu „miză mare”, este important ca fiecare etapă a procesului de pregătire să fie realizată de profesioniști pe deplin pregătiți și certificați, de preferință într-un laborator certificat CLIA (adică inspectat de guvern) sau acreditat CAP (College of American Pathologists).

Trebuie remarcat faptul că procesul FFPE nu este standardizat în mod universal, iar instituțiile din întreaga lume pot utiliza protocoale ușor diferite cu soluții de formol diferite sau pot adapta altfel procesul la preferințele și cerințele lor. Ceea ce urmează este o prezentare generală a procesului și descrieri a ceea ce presupune fiecare etapă, precum și unele variații comune.

Achiziționarea țesuturilor

Primarul prelucrării țesuturilor este etapa necesară de achiziție a țesuturilor. Acesta este, de fapt, elementul cel mai dificil de controlat, deoarece este împletit cu îngrijirea pacienților, conformitatea cu 41CFR46 și, în SUA, cu supravegherea comisiei interne de evaluare (IRB). Particularitățile procedurii medicale și convențiile de îngrijire standard sunt importante, deoarece pot afecta variabile precum intervalele de timp dintre administrarea anesteziei și ligatura vaselor, prelevarea țesutului și timpul scurs înainte de fixare, oricare dintre acestea putând avea un impact asupra calității specimenului. De exemplu, este probabil să apară modificări ale ARN-ului și proteinelor în timpul intervalului de timp, cunoscut sub numele de timp de ischemie caldă, dintre ligatura alimentării cu sânge și îndepărtarea țesutului (Dash, et al., 2002). Acest timp de ischemie poate varia de la câteva minute la câteva ore, în funcție de organ, de procedurile standard de operare ale instituției, de chirurg și de alt personal medical implicat, precum și de abordarea chirurgicală. Din acest motiv, s-a recomandat ca acest timp să fie înregistrat pentru fiecare specimen și să fie menținut la un nivel minim (Hewitt, et al., 2008).

Procesarea țesuturilor EFP

După ce proba de țesut a fost achiziționată, poate fi necesară o triajare, disecție sau microdisecție suplimentară (denumite colectiv „grossing”) pentru a izola și pregăti porțiunea specifică de țesut care va fi trecută prin etapele de procesare rămase. În prezent, prelucrarea țesuturilor este adesea complet automatizată până la etapa finală, încorporarea, care poate fi realizată manual. Există multe procesoare de țesuturi disponibile, dar toate vor urma secvența primelor patru etape prezentate mai sus. Automatizarea diferitelor etape ajută la eliminarea variațiilor în procedură ca sursă de variație a rezultatelor experimentale între diferite probe FFPE.

Fixare

Fixarea este etapa inițială în prelucrarea țesuturilor FFPE. Factorii critici care trebuie luați în considerare includ soluția care urmează să fie utilizată, durata de timp permisă pentru fixare, precum și grosimea și proprietățile histologice ale probei de țesut care urmează să fie fixată.

– Soluție

Fixatorul care este utilizat de majoritatea laboratoarelor este formalina cu tampon neutru, 10%. Formalina este un lichid care este format din 37-40% formaldehidă și 10% metanol (în greutate) în apă; astfel, o soluție de 10% formalină conține aproximativ 3,7% – 4% formaldehidă și 1% metanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). În realitate, formaldehida există în soluție în principal sub formă de monomeri sau mici polimeri de metilenglicol (metandiol, formaldehidă monohidrat) care se formează prin reacția reversibilă a formaldehidei cu apa. Polimerii cu greutate mare de metilenglicol sunt numiți paraformaldehidă și vor precipita din soluție, dar metanolul încetinește acest proces de polimerizare, motiv pentru care este inclus în soluțiile de formalină. Formalina diluată cu apă (cum ar fi formalina 10%) – și mai ales dacă este o soluție tampon – va conține în principal monomeri, deoarece numărul mare de molecule de apă descompune orice polimeri de metilen glicol care ar fi existat în mod normal într-o soluție cu o concentrație mai mare de formaldehidă (Kiernan, 2000). Se adaugă, de asemenea, tampoane, componenta rămasă din formalină, deoarece formaldehida are tendința de a se oxida în acid formic (Fox, et al., 1985). Acidul formic în fixarea țesuturilor poate duce la precipitarea granulelor de pigment de formol (hematină acidă) care pot semăna cu pigmenții produși de unii paraziți (Pizzolato, 1976). Tamponarea formalinei previne acest lucru. Agenții de tamponare obișnuiți includ carbonatul de magneziu, carbonatul de calciu, citratul, Tris și tampoanele de fosfat (Hewitt, et. al., 2008). Formolul comercial conține adesea tampoane de fosfat. „Neutru-tamponat”, care este de obicei modul în care se prepară formalina, înseamnă pur și simplu că pH-ul este menținut la aproximativ 7.

– Proces și mecanism

Din cauza greutății moleculare scăzute a formaldehidei și a metilenglicolului, formalina (în principal metilenglicolul în soluție) pătrunde în țesuturi relativ repede, cu o viteză care depinde de tipul de țesut, dar cu o viteză medie de 1 mm/oră (Hewitt, et al., 2008). Prin urmare, protocoalele de fixare vor varia în funcție de tipul de țesut care urmează să fie fixat. Odată ajunsă în interiorul țesutului, fracțiunea de molecule de formaldehidă care este prezentă în soluție va începe să se reticuleze cu proteinele, dar acest lucru se întâmplă cu o viteză mult mai mică decât viteza de difuzie. Reacția formaldehidei cu țesutul o scoate din soluție și atrage reacția reversibilă de transformare a formaldehidei în metilenglicol înapoi în direcția formaldehidei, astfel încât se produce mai multă formaldehidă, chiar dacă aceasta este consumată (Fox, et al., 1985). Lanțurile laterale ale aminoacizilor de lizină sunt cele mai reactive cu formaldehida, dar altele care sunt oarecum reactive cu formaldehida includ arginina, asparagina, histidina, glutamina, serina și tirozina (Howat și Wilson, 2014). În urma reacției, gruparea hidroximetil rezultată, atașată complexului, poate reacționa în continuare cu aceeași proteină sau cu alte proteine, formând astfel punți metilenice stabile (proteină-CH2-proteină) (Kiernan, 2000). Aceasta este cea care produce insolubilitatea și rigiditatea țesuturilor care au fost fixate în formol și astfel conservate. Sunt necesare aproximativ 24-48 de ore pentru ca această reticulare să se producă în mod suficient în tot țesutul (Thavarajah, et al., 2012), dar s-a recomandat să nu se lase mai mult de 36 de ore pentru acest proces, deoarece fixarea pentru o perioadă mai lungă de timp va scădea calitatea biomoleculelor din probele FFPE, cum ar fi prin scurtarea lungimii acizilor nucleici care pot fi extrași (Hewitt, et al., 2008).

– Limitări

Beneficiul major al utilizării formaldehidei – în special sub formă de formol neutru tamponat, 10% formalină – este că aceasta conservă o gamă largă de țesuturi și componente. Cu toate acestea, are și limitări. De exemplu, o combinație de formaldehidă cu glutaraldehidă (C5H8O2), sau o soluție de glutaraldehidă singură, este utilizată de obicei pentru microscopia electronică (Kiernan, 2000), deoarece aceste soluții sunt mai bune pentru conservarea structurilor tisulare în acest scop. Rețineți că țesuturile pregătite cu o soluție de glutaraldehidă sau de glutaraldehidă-aldehidă nu vor fi considerate probe FFPE. O altă provocare este recuperarea moleculelor de ADN și ARN din țesuturile FFPE, deoarece formolul tinde să modifice acizii nucleici – chiar până la punctul de a introduce mutații artificiale în ADN – și să le descompună în fragmente mici (Srinivasan, Sedmak și Jewell, 2002). Cu toate acestea, este posibil să se extragă fragmente de ADN și ARN din țesutul FFPE care sunt adecvate pentru analiză, așa cum este descris într-un protocol scris de Tang, et al. (2009), un factor-cheie în recuperarea acizilor nucleici fiind digestia adecvată a proteazei. Sunt disponibile, de asemenea, kituri comerciale pentru extracția de acid nucleic din probele FFPE.

– Grosimea probei

Un alt punct important de luat în considerare în ceea ce privește fixarea în formol este grosimea probei de țesut. În timp ce formalina pătrunde relativ repede în țesut, după cum s-a menționat mai sus, grosimea țesutului va afecta calitatea probei fixate. Va fi nevoie de mai mult timp pentru ca formalina să ajungă în centrul unor mostre de țesut mai groase. În timp ce formalina difuzează treptat în zonele cele mai interioare ale probei, regiunile exterioare vor fi început deja procesul de fixare, astfel încât biomoleculele de acolo au mai multe șanse să se degradeze în timpul îndelungat necesar pentru o fixare totală. În plus, dacă se respectă limitele de timp (cum ar fi un maxim de 36 de ore, după cum s-a menționat mai sus), atunci există posibilitatea ca proba de țesut să nu fie suficient de bine fixată (conservată) în întregime. Din acest motiv, țesuturile pentru fixare care au o lățime mai mare de câțiva milimetri sau poate unul sau doi centimetri ar fi mai bine disecate în segmente mai subțiri pentru o fixare optimă (Hewitt, et al., 2008). Instituțiile pot avea protocoale diferite pentru durata de timp și volumul de fixativ necesar pentru eșantioane de țesut de diferite lățimi, dar, în general, raportul dintre volumul de fixativ și volumul de țesut ar trebui să fie de 10:1 (Klatt, 2016).

Deshidratare

Cea de-a doua etapă în prelucrarea eșantioanelor FFPE este deshidratarea. Deoarece parafina este imiscibilă cu apa, toată apa din soluția de formol trebuie eliminată din țesut înainte ca parafina să se infiltreze în el. O serie de soluții de alcool (adesea etanol), începând frecvent cu 70% și progresând până la alcool 100%, va fi utilizată pentru a elimina practic toată apa din țesut. Pentru o deshidratare optimă este necesară utilizarea de soluții noi sau înlocuirea frecventă a soluțiilor folosite, deoarece alcoolul se va dilua din ce în ce mai mult odată cu utilizarea. De asemenea, este imperativ ca această etapă să fie finalizată complet (cu suficient timp rezervat pentru această etapă), deoarece o deshidratare insuficientă poate duce la degradarea țesutului (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Curățarea

Din moment ce parafina nu este, de fapt, nici ea nu este miscibilă în alcooli, următorul pas este eliminarea alcoolului cu o substanță care este miscibilă cu parafina. Această etapă este cunoscută sub numele de clearing, iar xilenul este agentul de clearing cel mai des utilizat (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Infiltrarea parafinei

După o fixare, deshidratare și clearing adecvate, țesutul poate fi supus în cele din urmă infiltrării (sau impregnării) parafinei. Această etapă nu este, de asemenea, standardizată, iar instituțiile din întreaga lume pot utiliza diferite parafine și amestecuri de ceară cu compoziție variată. Parafinele au puncte de topire și texturi diferite care au un impact asupra blocului final de țesut și a caracteristicilor sale. În Statele Unite, precum și în Europa de Vest, se utilizează în mod normal parafine sintetice cu puncte de topire scăzute (55°C-63°C) pentru cele mai bune rezultate. Latexul, dimetilsulfoxidul și „plastifianții” brevetați pot fi incluși în formulare pentru a modifica textura și maleabilitatea probei finale de țesut (Hewitt, et al., 2008).

Națiunile din alte părți ale lumii vor încorpora adesea ceară de albine în formulările lor pentru a îmbunătăți maleabilitatea și a scădea temperatura de topire a parafinei de calitate scăzută utilizate. Cu toate acestea, ceara de albine conține contaminanți, cum ar fi polenul, și scade calitatea probei finale. Temperaturile de topire mai ridicate trebuie evitate, deoarece acestea duc ulterior la o deparafinare diminuată și insuficientă a specimenului de țesut, precum și la o scădere a cantității de acizi nucleici recuperați din țesut (Hewitt, et al., 2008).

Încorporarea în parafină

Ultima etapă în prelucrarea probelor FFPE este încorporarea în parafină. Proba de țesut infiltrată cu parafină este înconjurată cu un strat de parafină. Trebuie să se aibă grijă să se orienteze corect blocul de țesut în matriță („casetă”), deoarece acest lucru are impact asupra planului de secționare atunci când secțiunile subțiri sunt tăiate din bloc cu un microtometru (Klatt, 2016). Odată ce învelișul de parafină s-a solidificat, blocul FFPE este pregătit pentru depozitare și va rămâne bine conservat timp de ani de zile, chiar până la zeci de ani (Hewitt, et al., 2008).

Secționare

După ce țesutul este încorporat, acesta este pregătit pentru secționarea pe microtometru. Deoarece țesutul nu este întotdeauna complet plat față de partea frontală a parafinei, histotehnologul trebuie, de obicei, să fie „cu fața” în bloc. Blocul de țesut este pus în suportul de bloc al microtomului și, în timp ce reglează unghiul suportului de bloc astfel încât să risipească cât mai puțin țesut posibil, histotehnologul rotește volanul, mișcând blocul în sus și în jos împotriva unei lame ascuțite. Blocul este tăiat până când o secțiune reprezentativă completă de țesut se află în fața blocului. Odată ce țesutul este pus în față, blocul este pus pe gheață pentru a se răci, ceea ce va facilita tăierea secțiunilor subțiri; parafina prea caldă va crea țesut comprimat cu secțiuni încrețite. Când blocul este răcit, acesta este plasat înapoi în suportul de bloc. Tehnicianul rotește din nou volanul, de data aceasta într-un ritm lent și uniform, pentru a crea secțiuni subțiri consecutive care se lipesc unele de altele, formând o „panglică”.” Panglica este așezată pe o baie de apă caldă (temperatura este menținută chiar sub punctul de topire a parafinei) pentru a netezi orice riduri care s-au format. Tehnicianul plasează apoi o lamelă de microscop în baia de apă și „adună” secțiunea (secțiunile) aleasă (alese) astfel încât să se lipească de lamelă.

Cea mai obișnuită grosime pentru secțiunile de țesut este între 3-5 micrometri (sau microni, pe scurt), care este grosimea unei singure celule. Lamele cu secțiuni de 3-5 microni sunt utilizate în mod normal pentru colorare, fie că este vorba de colorarea standard cu Hematoxilină & Eozină (H&E), de o colorare specială sau de o colorare imunohistochimică (IHC). Cercetătorii vor solicita adesea „bucle” în loc de secțiuni subțiri pe lame. Curlurile sunt secțiuni mai groase (10 microni sau mai mari) care sunt introduse în tuburi Eppendorf și sunt utilizate, în general, ori de câte ori este nevoie să se extragă ARN sau ADN din probele FFPE. Secțiunile groase pot fi, de asemenea, puse pe lame în loc de tuburi; acest lucru este optim atunci când doar o parte din țesut va fi utilizată pentru extracție. În acest caz, țesutul este răzuit de pe lamă și pus într-un tub. Probele FFPE care au fost secționate sunt stabile din punct de vedere structural și, dacă sunt tratate și depozitate în mod corespunzător, pot fi utilizate pentru analize microscopice pentru o perioadă de timp după ce a avut loc secționarea, dar dacă urmează să se efectueze extracții chimice, atunci, în general, secțiunile trebuie utilizate cât mai curând posibil după tăiere pentru a preveni degradarea oxidativă și biologică a moleculelor țintă expuse.

Cercetați informații despre histologia și obținerea de blocuri FFPE reprezentând indicații specifice? Consultați pagina noastră de resurse privind histologia. Lab-Ally este lider în industrie în ceea ce privește conformitatea cu 45CFR46 și 21CFR11, biospecimeni umani proveniți din surse etice, bioinformatică, gestionarea datelor științifice și multe altele.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Fixarea formaldehidei. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Modificări în expresia genetică diferențială din cauza timpului de ischemie caldă a specimenelor de prostatectomie radicală. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Manipularea țesuturilor și pregătirea probelor în patologia chirurgicală: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehida, formalina, paraformaldehida și glutaraldehida: Ce sunt și ce fac. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Retrieved from http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Pigmentul formalină (hematină acidă) și pigmenții înrudiți. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Fixarea țesuturilor și efectul fixatorilor moleculari asupra procedurilor de colorare din aval. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Bazele chimice și fizice ale fixării de rutină a formaldehidei. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids (Efectul fixatorilor și al prelucrării țesuturilor asupra conținutului și integrității acizilor nucleici). The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). Extracția ADN din țesuturi fixate în formol și încorporate în parafină. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Prelucrarea țesuturilor. Mercer University School of Medicine, Savannah. Retrieved from http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accesat la 28 decembrie 2016

.