PMC

Rezultate reprezentative

Capacitatea testelor în plăci de a evalua cu exactitate titlurile virale se bazează pe numeroși factori: selecția adecvată a celulelor gazdă, medii și condiții de creștere adecvate pentru viabilitatea celulară și virală, propagarea virală imobilizată și o determinare exactă a perioadei de incubare virală pentru a permite un timp adecvat pentru formarea de plăci distincte și numărabile.

Pentru acest studiu, au fost aleși viruși din trei familii reprezentative pentru a demonstra diferențele în: selecția suprapunerii, perioadele de incubare și morfologia plăcilor în diferite tipuri de probe. Encefalita echină venezueleană (VEEV) a fost selectată ca model viral (+)ssRNA, care poate provoca boli semnificative la speciile de ecvidee și la om și reprezintă familia Togaviridae. Tulpina Influenza B Taiwan, un virus segmentat (-)ssRNA care infectează în principal oamenii, reprezintă familia Orthomyxoviridae. Virusul febrei din Valea Riftului (RVFV), un virus de origine artropodă (-)ssRNA care infectează în principal artropodele, rumegătoarele și oamenii, a fost selectat ca reprezentant al familiei Bunyaviridae.

Pentru RVFV (figura 1), titlurile au fost determinate dintr-o soluție stoc a unei tulpini vii atenuate recombinante MP12 de RVFV într-un format de placă cu 12 godeuri, utilizând suprapuneri de CMC, agaroză sau Avicel care au fost incubate una lângă alta timp de 72 de ore după infecție (hpi). O placă reprezentativă care prezintă diluții cuprinse între 10-4 și 10-7 poate fi observată în panoul A. Plăcile care utilizează CMC și agarose au prezentat plăci mici, clare și distincte, cu o margine circulară bine definită. Plăcile cu o suprapunere lichidă au fost ușor mai abundente și mai mari în comparație cu plăcile de agaroză și CMC și au prezentat o margine mai puțin distinctă. Titrurile virale au fost comparate în panoul B, toate suprapunerile având performanțe comparabile.

Pentru a obține o comparație vizuală mai clară între suprapuneri pentru MP12, împreună cu o dimensiune mai mare a eșantionului pentru a determina reproductibilitatea, s-a testat, de asemenea, o placă cu 6 godeuri în triplu exemplar (figura 2). În formatul de placă cu 6 godeuri, utilizarea unei suprapuneri CMC a arătat plăci mai mici decât suprapunerile de agaroză sau lichide, care au fost comparabile ca mărime una cu cealaltă. În timp ce titlurile virale au fost similare între toate cele trei suprapuneri (panoul D), plăcile formate în suprapunerile de agaroză și lichid s-au dovedit a fi mai ușor de numărat datorită dimensiunii lor mai mari.

În contrast cu RVFV, titlurile VEEV și morfologia plăcilor între diferitele suprapuneri au variat în mod semnificativ (figura 3A). Plăcile formate în suprapunerile CMC au demonstrat o morfologie clară și distinctă atunci când s-a utilizat un format de placă cu 12 godeuri, în detrimentul dimensiunii și sensibilității plăcilor (panoul B). Spre deosebire de CMC, utilizarea suprapunerilor de agaroză și de lichid a dus la apariția unor plăci semnificativ mai mari, ceea ce indică o inhibiție virală mai mică și o sensibilitate crescută la replicarea VEEV. Acest lucru a fost confirmat anterior prin compararea exclusivă a agarosei cu CMC într-o lucrare publicată de Juarez et al.4. În timp ce suprapunerile de agaroză și lichide au produs plăci mai mari decât CMC, plăcile au avut margini slab definite și au fost dificil de numărat într-un format de 12 godeuri, suprapunerile lichide oferind cea mai mare difuzie a marginilor. Atunci când plăcile au fost încercate în plăci cu 6 godeuri (figura 4), formatul mai mare cu 6 godeuri a anulat problema plăcilor evident mari care erau dificil de diferențiat în formatul cu 12 godeuri, suprapunerile de agaroză și lichide dovedindu-se superioare suprapunerilor CMC în ceea ce privește definirea și sensibilitatea plăcilor (figura 4D).

În comparație cu RVFV sau VEEV, gripa prezintă câteva provocări unice la placare, cum ar fi cerința unei proteaze externe. Sensibilitatea virusului gripal la diferite selecții de suprapunere a fost, de asemenea, bine documentată în trecut, deoarece au fost observate schimbări semnificative atunci când au fost utilizate modificări atât de minore, cum ar fi diferite mărci de agaroză9.

În mod interesant, pentru tulpina de gripă B Taiwan, utilizarea CMC ca suprapunere a dus la obținerea unor plăci semnificativ mai mici, care au fost dificil de numărat și s-au dovedit a fi dificil de evaluat în mod fiabil (figura 5A). Utilizarea unei suprapuneri de agaroză a furnizat cele mai bune plăci (panoul C) și a dus la o colorație de fond mai întunecată (probabil datorită viabilității crescute a monostratului) și a arătat plăci mai clare și mai clare în comparație directă cu utilizarea suprapunerii lichide (panoul B).

Un avantaj distinct al polimerilor lichizi față de suprapunerile solide și semisolide, cum ar fi agaroza și CMC, constă în ușurința de îndepărtare și aplicare. Suprapunerile semisolide necesită încălzire, iar solidificarea se poate dovedi problematică la manipulare și îndepărtare. Pentru a profita de aceste avantaje și pentru a determina caracterul practic al utilizării Avicel într-o manieră de mare randament pentru RVFV, a fost testat un format de placă cu 96 de godeuri la diferite concentrații de suprapunere (figura 6). Pentru RVFV MP-12, s-au efectuat diluții în patru exemplare atât la concentrații finale de Avicel de 0,6 %, cât și de 1,2 %. Aplicarea și îndepărtarea stratului de acoperire s-au dovedit a fi simple, fără a se observa diferențe aparente între replici sau între concentrații, demonstrând un grad ridicat de reproductibilitate. Atunci când au fost marcate, plăcile au fost distincte și au putut fi numărate cu ochiul liber, demonstrând fezabilitatea utilizării suprapunerilor lichide într-o manieră de mare randament pentru RVFV.

Figura 1: Comparații ale suprapunerilor de plăci RVFV utilizând plăci cu 12 godeuri. Veros a fost plasat la 2,5 x 105 celule în plăci cu 12 godeuri și infectat cu 200 µl folosind aceeași probă de pornire diluată în serie de MP12. După infectare, s-au aplicat suprapuneri de 1,5 ml de agaroză 0,3 %, Avicel 0,6 % sau CMC 1 % (concentrații finale), pentru a compara direct suprapunerile, așa cum se demonstrează în panoul A. Plăcile au fost numărate și colorate în panoul B.

Figura 2: Comparații ale suprapunerilor de plăci RVFV utilizând plăci cu 6 godeuri. Veros a fost plasat la 5 x 105 celule în plăci cu 6 godeuri și infectat cu 400 µl utilizând aceeași probă de pornire diluată în serie de MP12. S-au aplicat trei ml de suprapuneri de agaroză 0,3 %, Avicel 0,6 % sau CMC 1 %, pentru a compara direct suprapunerile, așa cum se demonstrează în panoul A, B și C. Experimentele separate au fost efectuate în mod identic cu cele descrise pentru panourile A-C, cu plăci numărate și colorate în panoul D (N = 3).

Figura 3: Comparații de suprapunere a plăcilor VEEV utilizând plăci cu 12 godeuri. Veros au fost plasate la 2,5 x 105 celule în plăci cu 12 godeuri și infectate cu 200 µl utilizând aceeași probă de pornire diluată în serie a tulpinii de vaccin VEEV TC-83. După infectare, s-au aplicat suprapuneri de 1,5 ml de agaroză 0,3 %, Avicel 0,6 % sau CMC 1 %, pentru a compara direct suprapunerile, așa cum se demonstrează în panoul A. Plăcile au fost numărate și colorate în panoul B.

Figura 4: Comparații de suprapunere a plăcilor VEEV utilizând plăci cu 6 godeuri. Veros au fost plasate la 5 x 105 celule în plăci cu 6 godeuri și infectate cu 400 µl utilizând aceeași probă de pornire diluată în serie de VEEV TC-83. După infectare, s-au aplicat suprapuneri de 3 ml de agaroză 0,3 %, Avicel 0,6 % sau CMC 1 %, pentru a compara direct suprapunerile, așa cum se demonstrează în panourile A, B și C. Experimentele separate au fost efectuate în mod identic cu cele descrise pentru panourile A – C, cu plăci numărate și colorate în panoul D (N = 3).

Figura 5: Comparații de suprapunere a plăcilor de gripă. Celulele MDCK au fost plasate la 5 x 105 celule în plăci cu 6 godeuri și au fost infectate cu 400 µl de inocul folosind același eșantion de pornire diluat în serie de Influenza B Taiwan. Nu s-a utilizat ser fetal bovin (FBS) în mediile de creștere sau în suprapuneri, deoarece FBS poate inhiba propagarea gripei prin inhibarea anumitor proteaze care sunt necesare pentru fuziunea virală. TPCK-tripsină a fost adăugată la toate straturile de acoperire înainte de aplicare, pentru a facilita fuziunea virală și intrarea virusului în celulele gazdă. După infectare, s-au aplicat 3 ml de suprapuneri de agaroză 0,3 %, Avicel 0,6 % sau CMC 1 % pentru a compara direct suprapunerile, așa cum se demonstrează în panoul A , B și C. Experimentele separate au fost efectuate în mod identic cu cele descrise în panourile A – C, cu plăci numărate și titerate în panoul D (N = 3). Deși a fost luată o medie pentru plăcile CMC, acestea s-au dovedit a fi dificil de numărat în mod fiabil, deoarece au demonstrat margini difuze și dimensiuni foarte mici ale plăcilor.

Figura 6:Suprapuneri de plăci de mare capacitate. O placă de 96 de godeuri de Veros placate cu 3 x 104 celule pe gode, au fost infectate cu 50 µl de inocul folosind același eșantion de pornire diluat în serie de RVFV MP12 timp de 1 oră, în patru exemplare. Pentru suprapuneri, au fost testate concentrații finale de Avicel de 0,6 și 1,2 % pentru a determina fezabilitatea și reproductibilitatea utilizării suprapunerilor lichide într-o manieră de mare capacitate, panourile A și B.

Tabelul 1:Condițiile de inoculare a testelor în plăci și tipurile de celule

Tabelul 2:Mediile de creștere a plăcilor și virale/celulare

Soluțiile de acoperire nu expiră atunci când sunt fabricate, atâta timp cât se menține sterilitatea.

Tabelul 3: Stocuri de suprapuneri