O procedură generală de blotting începe cu extragerea ARN-ului total dintr-o probă de țesut omogenizat sau din celule. ARNm eucariot poate fi apoi izolat prin utilizarea cromatografiei cu oligo (dT) celuloză pentru a izola numai acele ARN-uri cu coadă poli(A). Probele de ARN sunt apoi separate prin electroforeză pe gel. Deoarece gelurile sunt fragile, iar sondele nu pot pătrunde în matrice, probele de ARN, separate acum în funcție de dimensiune, sunt transferate pe o membrană de nailon prin intermediul unui sistem de blotting capilar sau în vid.
Configurarea sistemului de blotting capilar pentru transferul ARN-ului de pe un gel de electroforeză pe o membrană de blotting.
O membrană de nailon cu sarcină pozitivă este cea mai eficientă pentru utilizarea în northern blotting, deoarece acizii nucleici cu sarcină negativă au o afinitate mare pentru acestea. Tamponul de transfer utilizat pentru blotting conține de obicei formamidă, deoarece aceasta scade temperatura de recoacere a interacțiunii sondă-ARN, eliminând astfel nevoia de temperaturi ridicate, care ar putea cauza degradarea ARN-ului. Odată ce ARN-ul a fost transferat pe membrană, acesta este imobilizat prin legare covalentă la membrană prin lumină UV sau căldură. După ce o sondă a fost marcată, aceasta este hibridizată cu ARN-ul de pe membrană. Condițiile experimentale care pot afecta eficiența și specificitatea hibridizării includ puterea ionică, vâscozitatea, lungimea duplexului, perechile de baze nepotrivite și compoziția bazei. Membrana este spălată pentru a se asigura că sonda s-a legat în mod specific și pentru a preveni apariția semnalelor de fond. Semnalele hibride sunt apoi detectate cu ajutorul unui film cu raze X și pot fi cuantificate prin densitometrie. Pentru a crea martori pentru comparație într-un northern blot, se pot folosi probe care nu prezintă produsul genic de interes după determinarea prin microarrays sau RT-PCR.
GelsEdit
ARN rulat pe un gel de agaroză cu formaldehidă pentru a evidenția subunitățile ribozomale 28S (banda superioară) și 18S (banda inferioară).
Eșantioanele de ARN sunt cel mai frecvent separate pe geluri de agaroză care conțin formaldehidă ca agent de denaturare a ARN-ului pentru a limita structura secundară. Gelurile pot fi colorate cu bromură de etidiu (EtBr) și vizualizate sub lumină UV pentru a observa calitatea și cantitatea de ARN înainte de blotting. Electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu uree poate fi, de asemenea, utilizată pentru separarea ARN-ului, dar este cel mai frecvent utilizată pentru ARN fragmentat sau microARN-uri. O scală de ARN este adesea rulată alături de probe pe un gel de electroforeză pentru a observa dimensiunea fragmentelor obținute, dar în probele de ARN total, subunitățile ribozomiale pot acționa ca markeri de dimensiune. Deoarece subunitatea ribozomală mare este 28S (aproximativ 5kb) și subunitatea ribozomală mică este 18S (aproximativ 2kb), pe gel apar două benzi proeminente, cea mai mare având o intensitate aproape dublă față de cea mai mică.
SondeEdit
Sondele pentru northern blotting sunt compuse din acizi nucleici cu o secvență complementară la tot sau la o parte din ARN-ul de interes, acestea pot fi ADN, ARN sau oligonucleotide cu un minim de 25 de baze complementare la secvența țintă. Sondele de ARN (riboprobe) care sunt transcrise in vitro sunt capabile să reziste la etape de spălare mai riguroase, prevenind o parte din zgomotul de fond. În mod obișnuit, se creează ADNc cu primeri marcați pentru secvența de ARN de interes, pentru a acționa ca sondă în cadrul unui Northern Blot. Sondele trebuie să fie marcate fie cu izotopi radioactivi (32P), fie cu chemiluminescență, în care fosfataza alcalină sau peroxidaza de hrean (HRP) descompune substraturile chemiluminescente producând o emisie detectabilă de lumină. Marcarea chemiluminescentă poate avea loc în două moduri: fie sonda este atașată la enzimă, fie sonda este marcată cu un ligand (de exemplu, biotina) pentru care ligandul (de exemplu, avidina sau streptavidina) este atașat la enzimă (de exemplu, HRP). Pelicula cu raze X poate detecta atât semnalele radioactive, cât și pe cele chemiluminescente, iar mulți cercetători preferă semnalele chemiluminescente deoarece sunt mai rapide, mai sensibile și reduc pericolele pentru sănătate care însoțesc etichetele radioactive. Aceeași membrană poate fi sondată de până la cinci ori fără o pierdere semnificativă a ARN-ului țintă.
.