3.1 OMV-uri: Compoziție, biogeneză și roluri funcționale
OMV-urile sunt nanostructuri bistratificate lipidice sferice rezistente și discrete, cu diametrul cuprins între 10 și 300 nm, derivate din învelișul celular și incapabile să se reproducă independent (Kulp și Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4) (Fig. 4). Desprinderea OMV-urilor a fost observată pentru prima dată în urmă cu mai bine de 50 de ani în micrografiile cu electroni de transmisie care descriu ultrastructura peretelui celular bacterian (Bladen și Waters, 1963; Bayer și Anderson, 1965; Chatterjee și Das, 1967). S-a stabilit că aceste structuri nanosferice cuprindeau o singură membrană care înconjoară un centru dens de electroni (Work et al., 1966). Alte studii din aceeași perioadă au raportat, de asemenea, prezența „globulelor extracelulare” în supernatantul fără celule al E. coli cultivate în condiții de creștere cu limitare a nutrienților (Bishop și Work, 1965; Knox și colab., 1966; Work și colab., 1966). Prin urmare, s-a emis inițial ipoteza că formarea de OMV-uri are loc numai în condiții de stres. Cu toate acestea, investigațiile ulterioare au demonstrat în mod clar că OMV-urile pot fi detectate și în condiții de non-stres, atât în laborator, cât și în mediul înconjurător (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). În prezent, se știe că OMV-urile contribuie la o multitudine de funcții biologice cheie, iar unul dintre primele roluri descrise vreodată pentru OMV-uri este implicarea lor în patogeneză, în special ca vehicule de livrare a factorilor de virulență (revizuit în Ellis și Kuehn, 2010). De-a lungul anilor, au fost atribuite funcții suplimentare OMV-urilor, în funcție de specie și de condițiile de cultură, inclusiv comunicarea intra/inter-specii, capacitatea de reacție la stresul de înveliș, achiziția de nutrienți, transferul orizontal de gene, acționând ca agenți „momeală”, precum și ca bunuri publice (pentru o descriere detaliată, a se vedea Kulp și Kuehn, 2010 și Schwechheimer și Kuehn, 2015). În general, OMV-urile par să promoveze supraviețuirea bacteriei în cadrul unei nișe de mediu specifice, ceea ce evidențiază relevanța lor pentru homeostazia bacteriană.
Fig. 4. Vezicule ale membranei externe de la bacteriile Gram-negative. (A) Reprezentarea unei vezicule de membrană externă (OMV-panou superior) derivată din învelișul celular bacterian (panou inferior). Sunt prezentate detalii ale membranei externe (OM) și ale membranei interne (IM), inclusiv proteinele transmembranare. Spațiul periplasmic, în care se găsește stratul de peptidoglican (PG), prezintă proteine periplasmice solubile, proteine prost pliate și acizi nucleici. Conținutul OMV ilustrează o parte din biomoleculele care au fost identificate atât pe membrana, cât și în lumenul acestora. (B și C) Micrografiile electronice de transmisie ale unei celule Synechocystis sp. PCC 6803 colorate negativ cu acetat de uranil care eliberează un OMV (B, mărire de 120.000 ×) și mediul extracelular concentrat fără celule de Synechocystis sp. PCC 6803 care prezintă mai multe OMV (C, mărire de 40.000 ×).
(A)Bazat pe Jan, A.T., 2017. Veziculele membranei externe (OMVs) ale bacteriilor Gram-negative: o actualizare a perspectivei. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numeroase studii au arătat că OMVs sunt îmbogățite în componente OM, și anume LPS și OMPs, precum și proteine periplasmatice, fragmente de PG și chiar acizi citoplasmatici și nucleici (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). Rapoartele timpurii nu au diferențiat, de fapt, MVs formate artificial în soluție (datorită comportamentului natural al lipidelor de regrupare în vezicule, prinzând fără discernământ materialul rezultat din liza bacteriană) de OMVs intacte. Mai recent, metodologiile îmbunătățite de izolare și tehnicile omice de ultimă generație au permis o analiză atentă a compoziției OMVs. În mod remarcabil, OMV-urile sunt de fapt îmbogățite în anumite componente celulare, în timp ce sunt sărăcite în altele (Lee et al., 2008), susținând ideea că selecția conținutului de încărcătură nu este un proces aleatoriu. De exemplu, conținutul OMV-urilor din Salmonella sp. a variat în funcție de condițiile de creștere testate: în OMV-urile izolate din celule aflate în condiții de abundență nutritivă, au fost detectate cu predilecție proteine citosolice implicate în traducere și în metabolismul celular, în timp ce în condiții de limitare nutrițională OMV-urile au fost îmbogățite în proteine membranare implicate în transportul nutrienților (Bai et al., 2014). În plus, o abordare bazată pe spectrometrie de masă a indicat faptul că în OMV nu a fost detectată nicio componentă specifică larg conservată în OMV (Schwechheimer et al., 2013), indicând încă o dată o compoziție variabilă. Una peste alta, este de așteptat ca compozițiile diferențiale ale OMV-urilor să fie legate atât de particularitățile învelișului celular dependente de tulpină, cât și de nișe ecologice distincte (Yoon, 2016).
Au fost propuse trei mecanisme de formare a OMV-urilor care nu se exclud reciproc. Într-un model, veziculația are loc atunci când legăturile încrucișate covalente dintre proteinele membranare și stratul PG sunt rupte local, fie printr-o scădere temporară a abundenței globale a legăturilor încrucișate, fie printr-o deplasare localizată a legăturilor încrucișate, promovând bombarea porțiunilor mici de OM. Un alt model implică nanoteritorii periplasmatice în care se acumulează proteine prost pliate și alte componente ale învelișului (LPS sau fragmente de PG). În urma acestei acumulări anormale și confinate de componente celulare, integritatea învelișului scade local, declanșând sângerarea porțiunilor de OM încărcate cu conținut lumenal. În cele din urmă, s-a propus, de asemenea, că anumite caracteristici biofizice particulare ale anumitor lipide ale OM pot promova veziculația prin identificarea integrării specifice a LPS sau a fosfolipidelor, ceea ce duce la modificări ale fluidității și flexibilității membranei. Se presupune, de asemenea, că mulți alți factori afectează dimensiunea, rata de producție și compoziția OMV-urilor, iar dacă există un proces consensual de biogeneză a OMV-urilor, acesta nu este în întregime caracterizat (Kulp și Kuehn, 2010; Schwechheimer și Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
În cercetarea în domeniul cianobacteriilor, domeniul OMV-urilor este încă destul de recent și rămân multe de explorat. Acest lucru este deosebit de bine ilustrat de faptul că cea mai veche publicație dedicată exclusiv studiului OMV-urilor cianobacteriene datează din 2014 (Biller et al., 2014). În acest studiu inovator, nu numai că se demonstrează că culturile controlate în laborator ale cianobacteriei marine Prochlorococcus eliberează în mod continuu OMV-uri, dar și că aceste vezicule pot fi găsite din abundență în probele de apă de mare. În plus, s-a demonstrat că OMV-urile Prochlorococcus au fost capabile să susțină creșterea culturilor de bacterii heterotrofe, implicând aceste structuri în fluxurile marine de carbon. În plus, au fost observate interacțiuni între fagii marini și vezicule, ceea ce arată potențialul OMV-urilor de a acționa ca agenți „momeală”. În general, autorii au ilustrat unele dintre rolurile fundamentale ale OMV-urilor și nenumăratele lor implicații pentru ecosistemele microbiene (Biller et al., 2014). Într-o publicație mai recentă, OMV-urile de Prochlorococcus au fost comparate cu cele ale altor trei heterotrofe marine, în încercarea de a dezvălui frecvența împachetării ADN-ului în vezicule și variația dintre diferiți taxoni (Biller et al., 2017). Prin examinarea cantității și distribuției ADN-ului asociat cu OMVs, s-a demonstrat că ADN-ul este încapsulat în mod diferențiat în cadrul și între populațiile de OMVs. În mod mai decisiv, această lucrare sugerează că mecanismul care a împachetat ADN în OMV-uri nu funcționează în mod egal în toate bacteriile (Biller et al., 2017). În plus față de Prochlorocococcus și de tulpinile marine Synechocococcus, s-a demonstrat că și alte cianobacterii formează și eliberează OMV-uri, inclusiv Synechocococcus sp. unicelular PCC 7002 (Xu et al., 2013) și Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), Jaaginema litorale filamentoasă Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017), și Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) și Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
În afară de rolurile descrise mai sus pentru OMV-urile derivate din cianobacterii marine (Biller et al., 2014), au fost propuse și alte funcții pentru aceste vezicule extracelulare. Eliberarea OMV-urilor de către cianobacterii ar putea funcționa ca o cale de secreție eficientă. S-a demonstrat că o tulpină Synechococcus sp. PCC 7002 modificată metabolic, căreia îi lipsesc două gene de glicogen sintetază, glgA-I și glgA-II, eliberează semnificativ mai multe OMV decât tulpina de tip sălbatic (Xu et al., 2013). Autorii au emis ipoteza că, întrucât s-a observat că acest mutant exporta spontan zaharuri solubile în mediu, OMV-urile observate ar putea fi legate de acest mecanism de secreție, chiar dacă conținutul de zahăr al OMV-urilor observate nu a fost evaluat (Xu et al., 2013). În plus, s-a demonstrat, de asemenea, că o tulpină Synechocystis sp. PCC 6803 căreia îi lipsește omologul TolC (esențial pentru mecanismele de secreție dependente de membrană; a se vedea figurile 1 și 3) eliberează semnificativ mai multe OMV decât tulpina parentală (Oliveira et al., 2016). Deoarece tolC-knockout a fost puternic afectat în secreția proteinelor intracelulare, a metaboliților și a compușilor exogeni, s-a propus că hiperveziculația ar putea satisface nevoia de secreție. În acord, s-a sugerat, de asemenea, că OMV-urile cianobacteriilor transportă materialul necesar pentru dezvoltarea biofilmului. Acest lucru a fost propus în urma observării veziculelor derivate din cianobionți în sporocarpul ferigii de apă Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Mai mult, deoarece materialul genetic a fost observat în interiorul acestor vezicule, acestea ar putea fi vectori pentru transferul lateral de gene între cianobiont și ferigă (Zheng et al., 2009). Cu toate acestea, OMV-urile cianobacteriene pot funcționa, de asemenea, ca un mecanism de disipare a stresului de înveliș: Gonçalves et al. au caracterizat un set de tulpini Synechocystis sp. PCC 6803 lipsite de mai multe componente ale translocazei IM implicate în sistemele de secreție dependente de TolC (Gonçalves et al., 2018). În mod interesant, printre diferitele tulpini care prezintă diferite capacități de eliberare a OMV-urilor, tolC-knockout (cel mai mare producător de OMV-uri din studiu) a fost singurul care a prezentat niveluri remarcabil de ridicate de transcriere a spy și degQ, care codifică proteine implicate în răspunsurile la stresul de înveliș, precum și supraexprimarea Spy și DegP (Gonçalves et al., 2018). Astfel, autorii au sugerat că deleția tolC provoacă stresul de înveliș și că hipervesiculația în tolC-knockout reprezintă un mecanism independent pentru a face față unor astfel de condiții stresante (Gonçalves et al., 2018).
.