Funcția proteinelor chaperone în asamblarea complexelor proteice implicate în procesele de aderare și fuziune a gameților

Complecși multiproteici în capacitarea spermatozoizilor și interacțiunea ZP

Când ajung la locul de fertilizare, ampulla, spermatozoizii trebuie să traverseze două bariere înainte de a fuziona cu membrana plasmatică a ovocitelor, sau oolema. Prima dintre acestea este un strat bogat în acid hialuronic al celulelor cumulus care înconjoară ovocitul, iar a doua este matricea extracelulară a ovocitului însuși, ZP (Hartmann et al. 1972). În ciuda dezvoltării atât a ZP, cât și a situsurilor de legare a acidului hialuronic în timpul spermatogenezei și a dobândirii potențialului de legare pe măsură ce spermatozoizii tranzitează epididimul, aceste celule au nevoie de o perioadă distinctă de ședere în tractul reproducător feminin înainte de a putea lua parte cu succes la astfel de interacțiuni (Austin 1951, Chang 1951). Modificările colective prin care trec spermatozoizii în acest mediu, denumite capacitare, permit celulelor să răspundă la semnalele care provin din complexul cumulus-oocit și să finalizeze un proces de exocitoză acrozomală, ceea ce le face competente pentru fuziunea cu oolema.

ZP este alcătuită dintr-o suită de sulfoglicoproteine, și anume ZP1, ZP2 și ZP3, care sunt foarte conservate la majoritatea speciilor de mamifere (deși un ligand suplimentar, ZP4/B, a fost raportat în ovocitele umane și de porc) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). În general, se consideră că acești liganzi guvernează legarea spermatozoizilor la majoritatea speciilor (a se vedea, de asemenea, Reid et al. (2011)). Cu toate acestea, este remarcabil faptul că, în prezent, sunt încă în curs de examinare diverse modele cu privire la identitatea receptorului primar al spermatozoizilor în cadrul ZP și la mecanismele prin care spermatozoizii aderă la această matrice (a se vedea, de asemenea, Visconti & Florman (2010)). În mod similar, investigațiile privind identitatea receptorului (receptorilor) corespunzător(i) de la suprafața spermatozoizilor care recunosc ligandul (liganzii) corespunzător(i) de pe ZP nu au reușit, de asemenea, să ofere răspunsuri definitive. Într-adevăr, există o literatură din ce în ce mai numeroasă de knock-out-uri murine ale unor candidați de proteine receptoare de bun augur (inclusiv β-1,4-galactosiltransferaza (GALT1), arilsulfataza A (ARSA) și molecula de aderență a spermatozoizilor 1 (SPAM1); pentru o listă completă, a se vedea Ikawa et al. (2010)) care nu reușesc fiecare să ducă la infertilitate completă (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Mai degrabă, se prezintă diferite grade de reducere a capacității de legare, ceea ce ridică posibilitatea ca acest proces să cuprindă un anumit grad de redundanță funcțională și ca o serie de proteine spermatice să acționeze în mod concertat pentru a media aderența ZP. Coordonarea activității acestor proteine pentru a asigura interacțiuni productive cu ZP devine astfel un obiectiv de cercetare important.

La majoritatea mamiferelor euteriene, capacitarea spermatozoizilor este considerată a fi inițiată prin activarea unei căi mediate de AMPc care culminează cu fosforilarea tirozinei a mai multor proteine spermatice (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Chaperonii moleculari ocupă un loc proeminent în această suită de proteine, HSP90AA1, HSP90B1 și HSPD1 fiind printre proteinele pentru care s-a dovedit că prezintă fosforilarea tirozinei ca o consecință a capacitatării (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). Modelele actuale sugerează că fosforilarea acestor chaperoni în timpul capacitarea declanșează rolul lor activ în asamblarea proteinelor de recunoaștere ZP în complexe și/sau în translocarea acestor complexe la suprafața spermatozoizilor în vederea pregătirii pentru fertilizare (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). În plus față de acest rol indirect în aderarea gameților, chaperonii de la suprafața spermatozoizilor au, de asemenea, funcții presupuse ca molecule de aderență care mediază recunoașterea sulfoglicolipidelor în timpul legării gameților (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Recent, tehnica PAGE nativă albastră (BN-PAGE), care a fost inițial dezvoltată pentru analiza complexelor multienzimatice ale lanțului de transport al electronilor (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), a fost adaptată pentru evaluarea complexelor multimerice de suprafață ale spermatozoizilor la șoareci și oameni (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Această tehnică permite rezoluția electroforetică a complexelor proteice native care își păstrează activitatea biologică. La spermatozoizii umani și de șoarece, utilizarea BN-PAGE în paralel cu blotting-ul Far-Western cu zone întregi solubilizate a evidențiat mai multe complexe multiproteice primare care posedă afinitate pentru ZP omologe (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

Un astfel de complex a fost raportat ca fiind format din componentele proteice ale complexului CCT/TRiC (CCT1-CCT8), o structură cu dublu inel care funcționează ca un chaperon molecular cu un rol cheie în reglarea formării complexelor multiproteice (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Dovezile presupuse sub formă de teste de co-imunoprecipitare, co-localizare și ligare de proximitate au identificat proteina de legare ZP 2 (ZPBP2) ca fiind una dintre cele mai convingătoare proteine client pentru complexul CCT/TRiC în spermatozoizii maturi (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Implicată inițial în legarea secundară a ZP, un studiu mai recent a arătat că șoarecii masculi nuli pentru ZPBP2 sunt subfertili și prezintă defecte în interacțiunea și penetrarea ZP (Lin et al. 2007). La șoareci, există dovezi suplimentare că anumite subunități ale complexului CCT/TRiC sunt translocate la suprafața spermatozoizilor în timpul capacitivării spermatozoizilor (Dun et al. 2011).

O altă clasă importantă de chaperoni care a fost identificată la suprafața spermatozoizilor și implicată în reglarea interacțiunilor ZP este familia HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Ca și în cazul complexului CCT/TRiC, chaperonii din familia HSP70 au, de asemenea, roluri bine documentate în facilitarea atât a transportului de proteine transmembranare, cât și a asamblării de complexe proteice stabile (Mayer & Bukau 2005). Un membru al familiei HSP70 care prezintă o expresie exclusivă (șoarece) sau predominantă (om) în testicule pare să fie esențial pentru fertilitatea masculină. Într-adevăr, expresia aberantă a acestui chaperon, HSPA2, a fost corelată cu un fenotip de infertilitate severă a factorului masculin la om, afectând în mod specific capacitatea spermatozoizilor de a interacționa cu ovocite omologe in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Atât la șoareci, cât și la oameni, HSPA2 are un rol fundamental în spermatogeneză, deleția țintită a proteinei la prima specie ducând la o oprire timpurie a acestui proces și la o absență concomitentă de spermatozoizi (Eddy 1999). La om, nivelurile de expresie ale HSPA2 au fost corelate pozitiv cu succesul fertilizării in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) și, prin urmare, se presupune că sunt capabile să prezică starea de fertilitate a bărbaților cu un grad ridicat de precizie (Ergur et al. 2002).

Caracterizarea HSPA2 în laboratorul nostru a arătat că acest chaperon este prezent în domeniul acrozomal al spermatozoizilor umani și este o componentă a cel puțin cinci complexe proteice cu masă moleculară mare (Redgrove et al. 2012), inclusiv un subset al celor care au demonstrat anterior că posedă afinitate pentru ZP (Redgrove et al. 2011). În concordanță cu aceste date, am asigurat dovezi că cel mai dominant dintre complexele HSPA2 conține două proteine suplimentare, ambele fiind implicate anterior în interacțiunile spermatozoid-zona (Redgrove et al. 2012). Mai mult, în concordanță cu rezultatele publicate de Huszar et al., am reușit să demonstrăm o reducere semnificativă a nivelurilor HSPA2 în spermatozoizii bărbaților cu leziuni izolate în ceea ce privește capacitatea lor de a se angaja în interacțiuni cu ZP din ovocite omologe in vitro (Redgrove et al. 2012). Lucrările noastre actuale se concentrează asupra faptului dacă deficitul de aderență la ZP fie rezultă din formarea aberantă a situsurilor de legare a ZP în stadiile timpurii ale spermiogenezei (Huszar et al. 2000), fie poate fi rezultatul incapacității HSPA2 de a participa la evenimentele de remodelare a suprafeței spermatozoizilor în timpul capacitatului, cum ar fi facilitarea asamblării și/sau prezentării receptorilor ZP pe suprafața spermatozoizilor în vederea pregătirii pentru interacțiunea cu ZP.

În plus față de propriile noastre lucrări privind asamblarea complexelor de la suprafața spermatozoizilor, Han et al. au identificat independent un complex multiproteic alternativ încărcat cu chaperoni pe suprafața spermatozoizilor de șoarece. Este interesant faptul că, așa cum s-a documentat mai sus, acest complex, care cuprinde HSPA5, calnexina, proteina membranară integrală 2B și ADAM7, este aparent asamblat în timpul capacitatului (Han et al. 2011). Deși funcția acestui complex nu a fost încă pe deplin elucidată, expresia ADAM7 a fost legată de prezența unor proteine ADAM suplimentare, ADAM2 și ADAM3 (Kim et al. 2006), care sunt importante pentru aderența spermatozoizilor la ZP (Muro & Okabe 2011). În plus, se știe că HSPA5 este implicată în promovarea aderenței spermatozoizilor de înaltă calitate la celulele epiteliale oviductale (OEC) în istmul tractului reproducător feminin. Se crede că formarea acestui rezervor are efecte favorabile supraviețuirii în ceea ce privește menținerea spermatozoizilor într-o stare necaptivată, quiescentă, în vederea pregătirii pentru eliberarea ovocitelor în ampulă (Topfer-Petersen et al. 2002). În mod interesant, chaperonii HSPD1 și HSPA5 au fost, de asemenea, localizați la suprafața OEC de bovine și au fost astfel implicați în legarea spermatozoizilor la OEC (Boilard et al. 2004).

De asemenea, în concordanță cu propriile noastre lucrări, complexul identificat de Han et al. s-a dovedit a fi rezident în microdomeniile membranare sau rafturile lipidice, regiuni specializate ale membranei care oferă o platformă pentru asamblarea și prezentarea funcțională a complexelor multiproteice (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Împărțirea complexelor chaperonice în mediul raft a fost, de asemenea, observată pentru HSPA2 în spermatozoizii umani (Nixon et al. 2011) și pentru componentele complexului CCT/TRiC în spermatozoizii de șoarece (Dun et al. 2011). Aceste domenii de membrană cuprind, de asemenea, o serie de proteine receptoare ZP putative suplimentare, inclusiv GALT1, ZP3R și SPAM1, ceea ce întărește rolul lor în remodelarea suprafeței spermatozoizilor și în legarea ZP (Fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Mecanismul (mecanismele) prin care aceste proteine sunt recrutate în plasele lipidice nu au fost încă rezolvate; cu toate acestea, s-a raportat că HSPA2 se leagă prin intermediul domeniului său ATPază de 3′sulfogalactosilglicerolipid, principala glicoproteină identificată în cadrul plasei lipidice a spermatozoizilor (Mamelak & Lingwood 2001).

În plus față de rolul putativ al rafturilor lipidice în repoziționarea complexelor chaperonice cheie și a proteinelor receptoare ZP, există, de asemenea, dovezi convingătoare că mulți receptori ZP putativi, cum ar fi ARSA și ZP3R, precum și mai mulți chaperoni moleculari prezintă o relocalizare dependentă de capacitare de la situsurile intracelulare, cum ar fi acrozomul, la suprafața spermatozoizilor pentru a pregăti celulele înainte de interacțiunile lor cu ZP (Nixon et al. 2009). S-a propus că contactul intim dintre membrana acrozomală exterioară și membrana plasmatică a spermatozoizilor este mediat prin legarea proteinelor complementare ale receptorului proteinei de atașare a factorului sensibil la N-etilmaleimidă solubilă (SNARE), ceea ce duce la formarea porilor de fuziune care oferă o cale pentru migrarea enzimelor la suprafața spermatozoizilor înainte de pierderea completă a conținutului acrozomal (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). În sprijinul acestui model, un studiu realizat de Brahmaraju et al. (2004) a demonstrat că administrarea de anticorpi împotriva VAMP și SNAP în vezicula acrozomală a inhibat legarea spermatozoizilor de ZP la șoarece.

Această pregătire progresivă a suprafeței spermatozoizilor a ridicat întrebări cu privire la natura „totul sau nimic” a exocitozei acrozomale. Cu toate acestea, asamblarea funcțională a complexelor SNARE pare, de asemenea, să stea la baza evenimentelor prelungite de fuziune a membranei spermatozoizilor care permit o pierdere completă a conținutului acrozomal (Tsai et al. 2010). Deși se consideră pe scară largă că contactul cu ZP inițiază această exocitoză acrozomală la majoritatea speciilor de mamifere, o serie de studii efectuate la șoarece au demonstrat că spermatozoizii care încep exocitoza acrozomală înainte de contactul cu ZP sunt în continuare capabili să fertilizeze ovocitul (Nakanishi și colab. 1999, Jin și colab. 2011). Acest fenomen poate fi valabil și în cazul spermatozoizilor de cobai (Huang et al. 1981) și de hamster (Yanagimachi & Phillips 1984). Astfel de constatări sugerează un rol important al ooforului cumulus în inițierea reacției acrozomului și ridică semne de îngrijorare cu privire la capacitatea studiilor in vitro efectuate cu structuri ale zonei ovocitare cu cumulus denudat de a raporta cu exactitate adevărata natură a reacției acrozomului și, într-adevăr, a interacțiunii ZP.

Nu în ciuda acestor controverse, moleculele asemănătoare chaperonilor au fost, de asemenea, implicate în exocitoza acrozomală în virtutea capacității lor de a promova asamblarea SNARE-urilor care conțin glutamină (Q-SNARE) și SNARE-urilor care conțin arginină (T-SNARE) în complexe ternare strânse (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). În mod interesant, studii elegante la porci au demonstrat că capacitarea induce o andocare stabilă a membranei plasmatice a spermatozoizilor cu membrana acrozomală externă în vederea pregătirii pentru fertilizare (Tsai et al. 2010). Studii mai recente efectuate de Tsai et al. (2012) au furnizat, de asemenea, dovezi privind prezența veziculelor mixte unilamelare care, printre alte funcții importante, permit recrutarea proteinelor secundare de legare a ZP la suprafața spermatozoizilor și posedă un complex SNARE trimeric nou, format din sintaxina 3, SNAP23, VAMP2 și o proteină suplimentară, complexina 2. Energia eliberată prin formarea unor astfel de complexe este, la rândul ei, utilizată pentru a iniția fuziunea membranară prin tragerea laolaltă a membranei plasmatice și a membranei acrosomale interne a spermatozoizilor (Tomes et al. 2002). Finalizarea acestui proces este critică în expunerea domeniilor spermatozoizilor care participă la evenimentele din aval ale fertilizării: legarea oolemelor și fuziunea.