Abstract
Decoctul Xiao-Yao-San (XYS) este o formulă din medicina tradițională chineză. Acest studiu a avut ca scop investigarea efectului XYS asupra capacităților cognitive și a mecanismului său de bază la șobolanii ovariectomizați. Șobolanii femele Sprague-Dawley au fost ovariectomizați și tratați cu XYS (3 g/kg sau 9 g/kg) prin gavare, cu injecție subcutanată de 17-β estradiol (E2, 2 μg/kg) ca un control pozitiv al medicamentului și gavare de 1 ml de soluție salină (0,9%) ca un control placebo. După 6 săptămâni de tratament, șobolanii au fost examinați cu ajutorul testului labirintului de apă Morris. Nivelul de estradiol din ser și hipocampus a fost măsurat prin ELISA. S-a efectuat colorarea Golgi pentru a observa morfologia neuronală în hipocampus. Apoptoza celulelor hipocampale a fost observată prin colorația TUNEL. Conținutul proteic al receptorilor N-metil-D-aspartat (NMDAR) 2A și 2B în regiunea CA1 a hipocampului a fost determinat prin Western blot și imunohistochimie. Expresia receptorului de estrogen (ER) și a semnalizării PI3K a fost detectată prin Western blot. Comparativ cu grupul sham, atât învățarea, cât și memoria au fost afectate la șobolanii ovariectomizați. Șobolanii tratați cu E2 sau cu doze mari de XYS au prezentat o mai bună învățare și memorie în comparație cu șobolanii tratați cu soluție salină. Doza mare de XYS a redus semnificativ latența de evadare în procesul de achiziție spațială; între timp, timpii de traversare și durata în cadranul de sondaj au crescut în procesul de sondaj spațial. Doza mare de XYS a promovat sinteza de novo a conținutului de E2 în hipocampus, dar nu a avut niciun efect semnificativ asupra nivelului seric de E2. Colorația Golgi a indicat că XYS în doze mari ar putea crește numărul de ramificații și densitatea spinilor dendritici în zona CA1 a hipocampului. Colorația TUNEL a arătat că doza mare de XYS a atenuat apoptoza neuronală indusă de ovariectomie. Nivelul de expresie al NMDAR2A și NMDAR2B în zona hipocampală CA1 a fost crescut de tratamentul cu XYS. Efectul benefic al XYS a fost prin activarea semnalizării ERα-PI3K. În concluzie, tratamentul cu doze mari de XYS poate îmbunătăți abilitățile cognitive ale șobolanilor ovariectomizați prin protejarea neuronilor hipocampali și restabilirea nivelului E2 hipocampal.
1. Introducere
Femeile la perimenopauză suferă adesea de anxietate și depresie legate de fluctuația nivelului de estrogen . În plus față de anxietate și depresie, uitarea este o altă plângere comună la femeile perimenopauză. Studiul Seattle Midlife Women’s Health Study a raportat că 60% dintre femeile de vârstă mijlocie au observat o deteriorare a memoriei . Studiul SWAN (Study of Women’s Health Across the Nation) a constatat că perimenopauza a fost un factor de risc dependent pentru uitarea auto-raportată la femeile de vârstă mijlocie . Deoarece creierul este o țintă importantă a reglării estrogenului, se speculează că deficitul de estrogen ar putea fi responsabil pentru deteriorarea cognitivă. Cu toate acestea, rezultatele studiilor observaționale privind influența asupra cogniției nu sunt pe deplin coerente . În plus, nu au fost încă stabilite intervenții hormonale terapeutice eficiente pentru îmbunătățirea performanțelor cognitive . În plus, alți factori, cum ar fi stresul perceput, starea de spirit și sănătatea fizică, pot contribui, de asemenea, la simptomele de memorie . Este mai probabil ca producția ovariană de estrogen să aibă un impact asupra memoriei în cazul unei scăderi bruște, mai degrabă decât în cazul unei tranziții naturale . Contrar inconsecvenței studiilor la om, constatările la animalele ovariectomizate susțin asocierea deficitului de estrogen cu modificările cognitive și eficiența terapiei de substituție hormonală .
Suplimentarea cu fitoestrogeni este o terapie alternativă populară pentru ameliorarea simptomelor menopauzei. Fitoestrogenii, cum ar fi flavonoidele, izoflavonele și lignanii, au o structură similară cu estrogenii steroidieni și pot juca un rol asemănător cu cel al estrogenilor prin activarea receptorilor de estrogeni (ER). O meta-analiză a susținut eficiența suplimentării cu izoflavone din soia în îmbunătățirea memoriei vizuale la femeile sănătoase aflate la postmenopauză . Studiul SWAN Phytoestrogen Ancillary Study a arătat că un aport ridicat de izoflavone sau lignină ar putea îmbunătăți viteza de procesare sau memoria verbală într-o anumită etapă a menopauzei, deși beneficiul a fost, de asemenea, legat de etnie/rasă . Efectul fitoestrogenilor asupra îmbunătățirii cogniției este mai evident indicat în studiile pe animale. Un extract hidroalcoolic din semințe de schinduf ar putea atenua leziunile neuronale hipocampale induse de ovariectomie (OVX-) și îmbunătăți performanțele de învățare și memorie într-un model de șobolan .
Xiao-Yao-San (XYS), care înseamnă pulbere fericită și lipsită de griji în chineză, este o formulă de medicină tradițională chineză (TCM) care este utilizată pentru a trata anxietatea și depresia la menopauză. Formula este alcătuită din Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fulinging), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) și Glycyrrhizae radix (Gancao). O analiză sistematică care a inclus 26 de studii randomizate a arătat că XYS a fost superior antidepresivelor, indicat de scorurile scalei de depresie Hamilton, și ar putea spori eficacitatea antidepresivelor în îmbunătățirea scorurilor scalei de autoevaluare a depresiei . Femeile la perimenopauză cu exoftalmie și palpitații ar putea beneficia, de asemenea, de tratamentul cu XYS . Unele acțiuni terapeutice ale XYS asupra ameliorării sindromului de menopauză pot fi atribuite prezenței fitoestrogenilor. O serie de studii au raportat prezența fitoestrogenilor în XYS. Ergosterolul se găsește în Poria cocos (Fuling) , iar β-sitosterolul este cunoscut ca fiind prezent în Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. au dezvoltat un test de detectare a prezenței fitoestrogenilor în formulele complexe de MTC, cu ajutorul unui receptor estrogenic chimeric/Gal4-element de răspuns reglat/luciferaza-reporter pentru detectarea prezenței fitoestrogenilor. Aceștia au analizat Bupleurum & Peony Formula, o formulă modificată a XYS cu aceleași plante principale și au găsit un conținut măsurabil de fitoestrogeni .
Prezența fitoestrogenilor în XYS sugerează că XYS are potențialul de a trata tulburările cognitive cauzate de deficitul de estrogeni. Un studiu pe animale a arătat că XYS ar putea atenua deficitul de învățare și memorie indus de stresul de imobilizare cronică (CIS) . În prezent, niciun studiu nu a evaluat efectul XYS asupra îmbunătățirii tulburărilor cognitive la femeile aflate la perimenopauză. Prin urmare, studiul actual a investigat efectul XYS asupra capacităților cognitive și mecanismul său de bază la șobolanii OVX.
2. Materiale și metode
2.1. Animale și tratament
În total, 60 de șobolani femele Sprague-Dawley au fost utilizați în acest studiu. Protocolul studiului a fost aprobat de Comitetul instituțional de etică pentru animale experimentale (număr de aprobare: ACU170802). Animalele au fost adăpostite cu acces liber la apă și la o dietă standard în condiții de temperatură și umiditate controlate. Șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în 5 grupuri (12 șobolani/grup): grupul sham, OVX + salină sau grupul O-salină, OVX + 17-β estradiol (E2) sau grupul O-E2, OVX + XYS 9 g/kg sau grupul O-XYS9 și OVX + XYS 3 g/kg sau grupul O-XYS3. Șobolanii au fost supuși operației OVX sub anestezie, așa cum a fost descris cu precădere . Pe scurt, s-a făcut o incizie longitudinală într-o treime de porțiune a trunchiului și la 1-2 cm distanță de fiecare parte a coloanei vertebrale. Țesutul adipos a fost scos ușor cu o pensetă. Ovarul a fost identificat, iar coarnele uterine au fost ligaturate. Ovarul a fost îndepărtat, iar incizia abdominală a fost suturată. În grupul sham, abdomenul a fost incizat fără OVX.
Tratamentul a fost inițiat la două săptămâni după operația de OVX și a durat șase săptămâni. Șobolanii din grupurile de tratament cu XYS au primit XYS prin gavare cu acul, într-o singură doză zilnică de 9 g/kg sau 3 g/kg. Injecția subcutanată de E2 (2 μg/kg) a fost stabilită ca un control pozitiv al medicamentului. Gavage de 1 ml de soluție salină (0,9%) a fost stabilit ca un control placebo. Decoctul XYS a fost utilizat sub formă de extract (1 g/ml, echivalent cu 1 g de ierburi brute/ml), care a fost furnizat de Spitalul afiliat al Universității de medicină tradițională chineză din Nanjing. Formula decoctului XYS a fost raportată în mod prețios . Doza de XYS utilizată în clinică pentru femeile la perimenopauză este de 175 g de ierburi brute/60 kg, ceea ce este echivalent cu 3,5 g/kg la șobolani. Referindu-ne la alte rapoarte experimentale pe modelul de șobolan, am stabilit doza mică la 3 g/kg și doza mare la 9 g/kg . Pulberea E2 (Cat. nr. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost dizolvată într-o cantitate mică de etanol, iar apoi s-a preparat o soluție de stocare de 20 μg/ml cu soluție salină 0,9%.
2.2. Testul Morris Water Maze
Funcția de învățare și memorie a șobolanilor a fost evaluată cu ajutorul testului Morris water maze (MWM) . Dispozitivul de experiment MWM este un bazin rotund (200 cm în diametru) cu apă de 38-40 cm înălțime. Temperatura apei este menținută constantă la 20-22°C. Testul WMW este alcătuit din trei părți, și anume, proba de achiziție spațială (cu o durată de 5 zile), proba de sondare spațială și proba de platformă vizibilă. În cadrul încercării de achiziție spațială, șobolanii au fost plasați ușor într-un cadran aleatoriu al rezervorului de apă, cu platforma ascunsă la 1,5 cm în cadranul de nord-est sub apă. Fiecărui șobolan i s-a permis să înoate timp de până la 60 s pentru a găsi platforma. Șobolanii care nu au reușit să găsească platforma în 60 s au fost ghidați către aceasta, iar latența a fost înregistrată ca fiind de 60 s. Latența de evadare a fost înregistrată de un sistem de analiză video (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, SUA). Șobolanii au fost antrenați de 4 ori pe zi. După 5 zile de antrenament, șobolanii au primit proba de sondaj spațial cu platforma îndepărtată din cadranul de nord-est. Șobolanii au fost plasați în aceeași locație de pornire din cadranul de nord-vest. Au fost înregistrate urmele de deplasare ale șobolanilor care căutau platforma în 120 s. Durata și timpii de traversare în cadranul țintă au fost calculați pentru a evalua reținerea memoriei spațiale. A doua zi după proba de sondaj spațial, șobolanii au primit proba de platformă vizibilă, similară cu antrenamentul cu platforma ascunsă, în care platforma a fost ridicată la 1,5 cm deasupra suprafeței apei și plasată în cadranul de sud-vest. Fiecare șobolan a fost eliberat de 4 ori și, de fiecare dată, dintr-un punct de intrare diferit. Au fost înregistrate latența de evadare, distanța de înot și viteza de înot.
2.3. Colectarea probelor
După terminarea testului MWM, șobolanii au fost toracotomizați și intubați în aorta ascendentă prin ventriculul stâng sub anestezie cu pentobarbital de sodiu (40 mg/kg prin injecție intraperitoneală). Sângele din trunchi a fost colectat cu ajutorul unui tub de separare a serului pentru detectarea E2. Hipocampi de la șase șobolani au fost separați de cortexul cerebral și de țesuturile cerebrale înconjurătoare, îndepărtați rapid, spălați cu PBS rece și congelați în azot lichid pentru detectarea E2 și Western blot. Trei țesuturi cerebrale neperfuzate au fost imobilizate în paraformaldehidă 4% timp de 24 h și utilizate pentru colorarea Golgi și imunohistochimie. Cei trei șobolani din stânga au fost perfuzați transcardial cu soluție salină rece, urmată de o fixare în paraformaldehidă 4% timp de 1 h. Creierele au fost apoi îndepărtate, fixate în paraformaldehidă 4% timp de 24 h și încorporate în parafină pentru colorarea TUNEL.
2.4. Detectarea E2
Eșantioanele de sânge au fost lăsate să se coaguleze la temperatura camerei și au fost centrifugate la timp de 15 min la 4°C pentru a separa serul. Țesuturile hipocampusului au fost cântărite, omogenizate în soluție salină rece și centrifugate la timp de 20 min pentru a colecta supernatantul. Conținutul de E2 în ser și în supranatantul omogenat de hipocampus a fost detectat cu ajutorul kitului ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).
2.5. Colorația Golgi
Hipocampul a fost tăiat în blocuri mici și prelucrat pentru colorația Golgi așa cum este descris . Pe scurt, blocurile de hipocampus au fost scufundate în soluția de colorare Golgi (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China) timp de 14 zile, timp în care soluția de colorant a fost înlocuită la fiecare 2-3 zile. Țesuturile au fost deshidratate cu sucroză 30% și secționate la 100 μm. Secțiunile au fost prelucrate prin deshidratare cu etanol, clarificate cu xilen și montate pe lame acoperite cu gelatină. Colorarea Golgi a fost realizată cu succes în toate probele. Morfologia neuronilor din hipocampus a fost observată la microscopul de lumină (Nikon, Tokyo, Japonia). Neuronii din regiunea CA1 a hipocampusului au fost analizați cu ajutorul Neuron J conectat în software-ul Image J. Au fost selectate cinci secțiuni pentru fiecare șobolan, iar spinii dendritici cu morfologie completă au fost selectați pentru fiecare secțiune . Au fost măsurate densitatea și punctele de ramificare a spinilor dendritici.
2.6. Imunohistochimie
Expresia subunităților 2A și 2B ale receptorului N-metil-D-aspartat (NMDAR) în hipocampus a fost determinată prin imunohistochimie conform procedurii standard . Anticorpii primari utilizați au fost anti-NMDAR2A de iepure (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) și anti-NMDAR2B de iepure (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China). Anticorpul secundar a fost anti IgG de iepure conjugat cu HRP (Servicebio).
2.7. Colorarea TUNEL
Schimbările morfologice din hipocampus au fost detectate prin colorarea TUNEL cu un kit comercial (Roche, Mannheim, Germania) conform instrucțiunilor. Secțiunile au fost supuse reacției colorimetrice DAB, urmată de colorarea cu hematoxilină. Nucleul celulelor apoptotice TUNEL-pozitive a fost maroniu la microscopul optic. S-au selectat cinci secțiuni pentru fiecare șobolan și s-au selectat trei câmpuri nerepetitive (mărire de 400x) pentru fiecare secțiune. S-a calculat procentul de celule TUNEL-pozitive în toate celulele.
2,8. Western Blot
Partea de creier hipocampal CA1 a fost extrasă rapid și tăiată în secțiuni mici conform Atlasului cerebral. Țesuturile de hipocampus au fost incubate peste noapte cu tampon de liză RIPA (conținând 100 Mm PMSF, achiziționat de la Servicebio). Resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare la timp de 10 min pentru a colecta supernatantul care conține proteine. Concentrația de proteine a fost determinată cu ajutorul kitului de analiză a proteinelor BCA (Pierce, Rockford, IL, SUA). Lizații de proteine (30 μg/lună) au fost separați prin SDS-PAGE 10% și electroblocate pe membrana PVDF. După ce a fost blocată cu 5% lapte degresat, membrana a fost probată peste noapte cu următorii anticorpi primari: anti-NMDAR2A de iepure (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, SUA), anti-NMDAR2B de iepure (1 : 2000, Millipore), anti-CYP19 de iepure (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), anti-ERα de iepure (1 : 2000, Millipore), iepure anti-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), iepure anti-fosfatidilinositol-3-kinaza (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), iepure anti-Bax (1 : 1000, Abcam), iepure anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) și iepure anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, SUA). GAPDH a fost detectat ca control intern. Apoi, membrana a fost probată cu IgG de capră anti-rabie de iepure conjugată cu peroxidază de hrean secundară (HRP-) (1 : 5000, Bioworld) timp de 1,5 h. Benzile au fost vizualizate prin metoda chemiluminiscenței. Densitatea optică medie a benzilor proteice a fost cuantificată cu ajutorul software-ului Image J.
2.9. Analiza statistică
Datele experimentale au fost analizate cu software-ul GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, SUA). Datele numerice au fost exprimate ca medie ± SD. Diferența dintre două grupuri a fost comparată prin testul t. Rezultatele încercării platformei ascunse au fost analizate prin ANOVA cu măsuri repetate grup × zi, urmată de post-hoc Tukey. Alte comparații multiple au fost analizate prin ANOVA cu o singură cale urmată de post-hoc Tukey. valoarea < 0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.
3. Rezultate
3.1. Decoctul de Xiao-Yao-San îmbunătățește capacitățile de învățare spațială și de memorie ale șobolanilor ovariectomizați
Capacitatea de învățare a fost mai întâi evaluată cu ajutorul probei de achiziție spațială. ANOVA cu măsuri repetate a arătat că atât tratamentul, cât și zilele de antrenament au afectat latența de evadare [Figura 1(a)]. Latența de evadare în toate grupurile a scăzut odată cu creșterea numărului de zile de antrenament (), iar diferența a fost, de asemenea, semnificativă în ceea ce privește tendința de scădere a latenței în cadrul fiecărui grup (). Nu a existat nicio interacțiune între tratament și zilele de antrenament (). În timpul primelor două zile de antrenament, nu s-a observat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește latența de evadare a fiecărui grup. Începând cu a treia zi de antrenament, latența de evadare a fost semnificativ mai lungă decât cea a grupului simulat; latența de evadare a grupului E2 și a grupului cu doze mari de XYS9 a fost mai scurtă decât cea a grupului cu soluție salină, dar nu a fost diferită de cea a grupului simulat. După 5 zile de antrenament, șobolanii au fost evaluați cu proba sonda pentru a testa memoria spațială. După cum se arată în figura 1(b), timpii de traversare, timpul de durată și procentul de timp de durată în cadranul sondei a fost semnificativ redus în grupul salin. Nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește timpul de durată în alte cadrane. Tratamentul cu XYS sau E2 ar putea restabili în mod semnificativ timpii de traversare și timpul de durată în cadranul de sondaj la nivelul grupului simulat. Pentru a exclude efectele factorilor de mediu și ale nivelurilor cognitive și de activitate ale animalelor experimentale asupra învățării și memoriei spațiale, șobolanii au fost, de asemenea, supuși încercării cu platformă vizibilă [Figura 1(c)]. Nu a existat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește latența de evadare, distanța de înot și viteza de înot între grupuri. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că învățarea și memoria spațială au fost afectate la șobolanii OVX, iar tratamentul cu doze mari de XYS ar putea îmbunătăți în mod eficient funcțiile cognitive afectate.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.2. Decoctul de Xiao-Yao-San crește conținutul de estrogen din hipocamp la șobolanii ovariectomizați
În continuare, am studiat efectul XYS asupra nivelului de estrogen la șobolanii OVX. După cum se arată în figura 2(a), tratamentul cu XYS nu a îmbunătățit nivelul de estradiol seric redus din cauza OVX; cu toate acestea, nu a existat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește nivelul de estradiol seric între grupurile de tratament cu șampon și OVX. De remarcat, doza mare de XYS și E2 a crescut nivelul de estradiol hipocampal în comparație cu soluția salină [Figura 2(b)]. Grupul O-XYS3 a avut în continuare niveluri de estradiol hipocampal mai scăzute decât grupul sham. Schimbarea conținutului E2 hipocampal nu poate fi explicată prin schimbarea conținutului E2 derivat din gonade, ci prin schimbarea sintezei in situ. Prin urmare, am detectat expresia CYP19, enzima finală în sinteza estrogenului, în hipocampus. Rezultatele au arătat că tratamentul cu XYS sau E2 ar putea crește expresia CYP19 în comparație cu grupul salin (), dar numai diferența dintre grupurile cu doze mari de XYS și grupul salin a fost semnificativă (). Tratamentul nu a restabilit nivelul CYP19 la cel al grupului simulat. Rezultatele sugerează că XYS a promovat expresia aromatazei în hipocampus, crescând astfel sinteza de novo a E2.
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Decoctul de Xiao-Yao-San reduce leziunile neuronale în hipocampul șobolanilor ovariectomizați
Morfologia celulară din hipocampus, în special în regiunea CA1, joacă un rol important în capacitatea cognitivă . Morfologia celulelor din hipocampus a fost analizată prin colorarea Golgi, așa cum se arată în figura 3(a). În comparație cu grupul sham, numărul de neuroni din grupul cu soluție salină a scăzut semnificativ, iar morfologia spinilor dendritici a fost deteriorată. Analiza suplimentară a neuronilor CA1 a arătat că numărul punctual de neuroni și densitatea spinării dendritice au scăzut semnificativ în grupul salin (figurile 3(b) și 3(c)). Tratamentul cu doze mari de XYS a crescut numărul de neuroni în hipocampus și a crescut numărul punctual de neuroni și densitatea coloanei vertebrale în regiunea CA1. Tratamentul cu E2 a avut același efect terapeutic ca și tratamentul cu doze mari de XYS. Cu toate acestea, doza mică de XYS nu a îmbunătățit în mod eficient leziunile neuronale din regiunea CA1 a hipocampului. În mod consecvent, apoptoza neuronilor hipocampali (CA1, CA3, DG) a fost redusă prin tratamentul cu doze mari de XYS sau E2 (Figura 4). Cu toate acestea, XYS în doze mici a putut reduce doar apoptoza neuronilor CA3, dar nu a avut niciun efect asupra neuronilor CA1 și DG. Împreună, doza mare de XYS ar putea reduce leziunile neuronale în hipocampus, în special în regiunea CA1.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Decoctul Xiao-Yao-San crește expresia hipocampală a NMDAR2A și NMDAR2B la șobolanii ovariectomizați.
Plasticitatea sinaptică este baza neurobiologică a învățării și memoriei pe termen lung, iar performanța în testul MWM este influențată de funcția NMDAR . Prin urmare, am estimat în continuare expresia subunităților NMDAR 2A și 2B în hipocampul CA1. Western blot (figurile 5(a) și 5(b)) a arătat că expresia NMDAR2A și NMDAR2B a fost redusă la șobolanii OVX. Tratamentul cu XYS sau E2 a crescut în mod semnificativ nivelul de expresie al acestor două proteine la același nivel cu cel din grupul sham. Imunohistochimia (Figura 5(c)) a arătat, de asemenea, că proporția de celule colorate pozitiv a crescut în grupurile de tratament. Comparativ cu grupul salin, doza mare de XYS a crescut semnificativ expresia atât a NMDAR2A, cât și a NDMAR2B ( și 0,013, respectiv), dar doza mică de XYS a putut crește semnificativ doar expresia NMDAR2A ().
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.4. Decoctul de Xiao-Yao-San activează calea de semnalizare PI3K prin ERα
Impactul E2 sau al fitoestrogenilor asupra fiziologiei este mediat de semnalizarea ER. Studiile au arătat că activarea kinazei reglate de semnal extracelular (ERK), o proteină kinază activată de mitogen, este necesară pentru efectele benefice ale E2 asupra memoriei . Fosforilarea ERK1/2 este dependentă de activarea PI3K . Prin urmare, am investigat efectul XYS asupra semnalizării ER-PI3K. După cum se arată în figura 6, doza mare de XYS și E2 a promovat semnificativ expresia ERα, ERα fosforilat (Ser118) și PI3K p110β (subunitatea catalitică) în comparație cu grupul salin. Activarea ERα-PI3K a redus și mai mult expresia factorului proapoptotic Bax și a îmbunătățit expresia factorului antiapoptotic Bcl-2. Cu toate acestea, XYS în doze mici nu a influențat semnificativ semnalizarea ERα-PI3K, ceea ce este în concordanță cu rezultatele din figurile 3 și 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Discuție
XYS a fost folosit de mult timp pentru a trata anxietatea și depresia perimenopauzală. Studiul nostru a explorat noua aplicație a XYS în tratamentul tulburărilor cognitive induse de OVX. Rezultatele au arătat că XYS a îmbunătățit în mod eficient învățarea spațială și memoria spațială la șobolanii OVX. Mecanismul posibil este că XYS promovează sinteza de novo a estrogenului în hipocampus, activând astfel calea de semnalizare ERα-PI3K și inhibând apoptoza neuronilor hipocampali.
Mecanismul care stă la baza XYS pentru tratamentul depresiei a fost studiat pe larg. XYS joacă un rol antidepresiv prin reglarea unei rețele cuprinzătoare care implică neurotransmițătorii, neurotrofinele, axa hipotalamo-hipofizo-suprarenale, aminoacizii și lipidele . Unele dintre aceste studii au arătat că XYS poate acționa asupra modificărilor cerebrale legate de stres. Testele in vitro au arătat că un ser care conține XYS ar putea inversa modificarea potențialului membranei mitocondriale, a concentrației de calciu liber și a ratei apoptotice a neuronilor indusă de stresul oxidativ . Studiul nostru a arătat că XYS a atenuat, de asemenea, apoptoza neuronală în regiunea hipocampusului la șobolanii OVX. Efectele antiapoptotice ale XYS sugerează că acesta a avut potențialul de a acționa asupra unei varietăți de procese patologice legate de apoptoza neuronală cerebrală.
Rezultatele studiului nostru au arătat că XYS ar putea restabili nivelul de estrogen în hipocampul șobolanilor OVX. Hipocampul este esențial pentru formarea memoriei și este bogat în ERs, iar estrogenul facilitează o sănătate cognitivă și sinaptică mai mare prin intermediul acestor ERs . Mai multe studii clinice au indicat eficacitatea terapiei de substituție hormonală asupra simptomelor cognitive legate de pierderea de estrogen la femei . XYS ar putea crește nivelul de estradiol în hipocampus, ceea ce ar trebui să fie baza crucială pentru eficacitatea sa în îmbunătățirea capacităților cognitive ale șobolanilor OVX. Cu toate acestea, XYS nu a crescut nivelul de estradiol seric. Acest lucru se poate datora faptului că estradiolul poate fi sintetizat de novo în hipocampus, în timp ce estradiolul seric provine din gonade . Rezultatele noastre au arătat că XYS a crescut expresia CYP19 în hipocampus, sugerând că E2 crescut în creier este probabil să fie derivat din hipocampus . Rezultatele studiului nostru au arătat că XYS a crescut expresia NMDAR2A și NMDAR2B în hipocampul șobolanilor OVX. Această constatare a fost în concordanță cu studiile anterioare. S-a constatat că estrogenul crește atât densitatea spinării dendritice, cât și numărul de sinapse în hipocampus prin modularea funcțiilor NMDAR la șobolanii OVX . Estrogenul ar putea, de asemenea, să restabilească morfologia neuronilor hipocampali la șobolanii îmbătrâniți prin restabilirea nivelului NMDAR2B la cel observat la nivelul tânăr în regiunea CA1; mai mult, estrogenul poate afecta mobilitatea NMDAR2A și NMDAR2B de-a lungul sinapsei . Activarea NMDAR, la rândul său, ar putea contribui la sinteza E2 hipocampal prin inducerea influxului de Ca2+ .
În plus față de NMDAR-uri, XYS poate regla expresia altor factori legați de cogniție în creier. Pierderea proteinei 95 a densității postsinaptice (PSD-95), a sinaptofizinei și a factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) în hipocampus a fost direct corelată cu deficitele de învățare și memorie . Efectul XYS la șobolanii CIS a fost legat de promovarea expresiei PSD-95 și a sinaptofizinei în hipocampus . S-a demonstrat, de asemenea, că XYS a crescut BDNF în cortexul frontal, în regiunea hipocampală CA1 și în amigdala șobolanilor CIS . În timpul procesului de tratament CIS al XYS, calea de semnalizare c-Jun N-terminal kinaza (JNK) a fost inhibată în hipocampus .
Deși nu am explorat în mod specific care este principala componentă activă a XYS asupra învățării și memoriei, rezultatele noastre sugerează că principala sursă de fitoestrogeni din XYS este un candidat demn de investigații suplimentare. Cercetarea antidepresivelor ne poate oferi, de asemenea, câteva indicii. Jiali Liu et al. au descoperit că Bupleuri radix (Chaihu) este principalul medicament antidepresiv din rețeta XYS pe baza analizei farmacochimice serice a fracțiunii de eter de petrol . Studiul in vitro a arătat că extractul de Bupleuri radix a promovat proliferarea celulelor de neuroblastom prin activarea căii PI3K/AKt . Activarea PI3K a fost, de asemenea, observată în studiul nostru. .
Rapoartele clinice actuale arată că XYS are un efect terapeutic antidepresiv semnificativ, dar nu există un studiu toxicologic clar privind toxicitatea și efectele secundare ale XYS în detaliu. În general, XYS poate fi considerat ca o rețetă fără prea multe efecte secundare. XYS are mai multe rețete modificate, ale căror ingrediente de bază sunt aceleași ca la XYS. O meta-analiză recentă a evaluat eficacitatea și siguranța XYS modificat în tratamentul sindromului perimenopauzal. Rezultatele reunite sugerează că XYS modificat ar putea fi mai eficient și mai sigur pentru tratamentul sindromului perimenopauzal în comparație cu terapia de substituție hormonală . Cu toate acestea, din cauza metodologiei deficitare a studiilor incluse, eficacitatea și siguranța XYS au nevoie de studii mai riguroase pentru a fi confirmate. Utilizând metoda rezonanței magnetice nucleare (RMN) 1H, grupul de cercetare al lui Xiaoxia Gao a raportat că fracțiunea de eter de petrol care conține componente lipofile a fost cea mai eficientă fracțiune pentru tratarea depresiei . Aceștia au raportat, de asemenea, că Bupleuri Radix, principala componentă antidepresivă, ar putea produce mai multe efecte toxice în ficatul sau rinichii șobolanilor sănătoși decât la șobolanii cu stres ușor imprevizibil cronic. Efectele toxice au fost asociate cu creșterea concentrației de acizi biliari, facilitarea degradării lizinei și perturbarea metabolică a sfingolipidelor, a glicerofosfolipidelor și a acizilor grași . Acest rezultat a fost coroborat într-un studiu metabolomic recent al pacienților cu depresie. XYS a jucat un rol antidepresiv prin reglarea sintezei de leucină, valină și izoleucină și a metabolismului acidului binar, acidului gras, arginei și prolinei . Aceste studii sugerează că este necesar să se monitorizeze îndeaproape starea pacientului cu ajustarea în timp util a dozei de medicament pentru a preveni efectele secundare toxice.
5. Concluzii
În acest studiu, am demonstrat că tratamentul cu doze mari de XYS a avut o eficacitate similară cu E2 în îmbunătățirea capacităților cognitive ale șobolanilor OVX. Efectul terapeutic a fost mediat de protejarea neuronilor hipocampali și de restabilirea nivelului E2 hipocampal. Calea de semnalizare ERα-PI3K a fost implicată în acest proces. Studiul nostru sugerează că XYS ar putea fi o opțiune pentru tratamentul tulburărilor cognitive la perimenopauză. În prezent, XYS este utilizat în principal în tratamentul anxietății și depresiei clinice. Sunt necesare mai multe date clinice pentru a verifica efectul său asupra îmbunătățirii funcției cognitive.
Disponibilitatea datelor
Datele utilizate pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile la cerere la autorii corespunzători.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu au conflicte de interese sub nicio formă.
Contribuțiile autorilor
Lina Liu și Fei Ge au contribuit în mod egal la această cercetare.
Recunoștințe
Acest studiu a fost sprijinit de Fundația Națională de Științe Naturale din China (Granturile nr. 81603578, 81503536, 81673795 și 81903974); Fundația de Științe Naturale a Provinciei Jiangsu (Grant nr. BK20181235); Biroul Provincial Jiangsu de Medicină Chineză Tradițională (Grant nr. YB2017066); Proiectul Planului de Dezvoltare a Științei și Tehnologiei din Nanjing (Grant nr. 201715072); Proiectul Spitalului de medicină chineză din provincia Jiangsu (Grant nr. Y2018CX09); și un proiect finanțat de Dezvoltarea programului academic prioritar al instituțiilor de învățământ superior din Jiangsu.
.