În acest studiu am emis ipoteza că diferitele metode de izolare a ARN vor avea un impact asupra rezultatelor atunci când se analizează expresia genelor în țesuturi. Metodele de extracție a ARN-ului pot fi caracterizate în linii mari fie prin extracție cu fenol:cloroform urmată de precipitare cu alcool (TRIzol), fenol:cloroform urmată de extracție în fază solidă (pe bază de coloană; miRVana și miRNeasy) și separare în fază solidă cu/fără rășină de afinitate (Norgen total și Isolate II). Aceste metodologii au fost dezvoltate în principal pentru extracția ARNm lungi și s-au bazat pe ipoteza că toate ARN-urile sunt purificate în mod egal. În plus, există o serie de considerente pentru alegerea unei anumite metode de extracție a ARN-ului, cum ar fi calitatea, cantitatea, prețul și ușurința de utilizare (timpul până la extracție). În prezenta lucrare, prezentăm date care arată că metoda utilizată pentru a extrage ARN-ul va produce, de asemenea, rezultate variabile în comparație cu diferite metode în aplicațiile din aval și, prin urmare, reprezintă un alt considerent important.
Acest studiu demonstrează că metodele de izolare a ARN-ului variază în ceea ce privește cantitatea și calitatea probelor de ARN și în analiza expresiei miARN-urilor și a genelor țintă. Am ales organe care pot fi dificil de izolat ARN din diferite motive. De exemplu, se observă adesea că izolarea ARN din creier duce la randamente scăzute din cauza conținutului ridicat de lipide. Acest lucru a fost deosebit de evident cu kitul Bioline Isolate II. Protocolul producătorului sugerează că ar trebui să se purifice până la 5 μg de ARN din 10 mg de creier de șobolan/șoarece. Cu toate acestea, manualul miRNeasy sugerează că ar trebui să se poată obține 5-20 μg de ARN din creier cu aceeași cantitate de material de intrare. Rezolvarea problemelor de pe site-ul web al producătorului descrie o problemă cu țesuturile bogate în lipide, și anume înfundarea coloanei și sugerează reducerea cantității de probă sau creșterea volumului tamponului de liză. Extracțiile noastre au fost efectuate în limitele sugerate de protocol. Ulterior, se sugerează efectuarea unei preextracții cu ajutorul reactivului TRIsure (echivalentul Bioline al TRIzol), apoi separarea pe coloană cu ajutorul kitului pentru a curăța faza apoasă. Această metodă ar fi apoi comparabilă cu metodele de extracție a ARN miRVana și miRNeasy RNA și ar putea duce la randamente mai bune pentru acest țesut. În plus, calitatea ARN-ului se corelează cu răspunsurile specifice țesutului la stresul fiziologic, atât înainte, cât și după moartea țesutului. Țesuturi precum plămânii și ficatul au, în mod caracteristic, RIN-uri scăzute și un vârf 28S mic, deoarece aceste țesuturi sunt predispuse la o degradare mai rapidă a ARN-ului de către niveluri ridicate de nucleaze. Pentru a inactiva nucleazele, țesutul este congelat rapid, iar decongelarea este împiedicată până când materialul cântărit este adăugat în tamponul de extracție. Deși decongelarea țesutului a fost împiedicată, nu putem exclude faptul că timpul scurs de la eutanasierea animalului și excizia organelor până la congelarea rapidă a fost un factor care a contribuit la valorile generale scăzute ale RIN și la unii produse de degradare observate la toate probele de plămâni, indiferent de kitul de izolare utilizat. O metodă alternativă de inactivare a nucleazelor este utilizarea unei soluții de stabilizare a ARN, cum ar fi RNAlater (ThermoFisher Scientific), care permite ca probele de țesut necongelate să fie prelucrate ulterior. Aceasta poate contribui la asigurarea integrității ARN-ului, dar nu este compatibilă cu toate procedurile de izolare a ARN-ului, iar utilizatorii ar trebui să verifice metoda lor specifică înainte de a efectua extracțiile. Adăugarea unui vârf după 60 s în unele probe în analiza Bioanalyser sugerează o contaminare cu gADN. Un tratament suplimentar cu DNază poate fi efectuat pe coloane cu unele kituri, însă este foarte recomandată o etapă de eliminare a gDNA în timpul etapei de transcriere inversă. Includerea acestei etape în metodele noastre poate explica de ce nu a existat nicio interferență atunci când s-a analizat expresia ARNm a probelor de plămâni Norgen, dar a avut un impact asupra analizei expresiei miARN, deoarece protocolul de analiză a miARN Taqman nu include eliminarea ARNg. În plus, puritatea probelor de ARN este un factor critic, deoarece, chiar dacă probele cu RIN > 7 ar trebui să funcționeze bine în majoritatea aplicațiilor din aval, cele care implică reacții enzimatice, cum ar fi qPCR, pot fi inhibate de nucleaze, ioni metalici sau contaminanți organici. În general, probele de ARN Bioline Isolate II au avut rapoarte 260/230 mai mici, iar contaminanții ar putea contribui la performanțele sale slabe. În cele din urmă, s-au observat diferențe în ceea ce privește îmbogățirea pentru miARN-uri în preparatul de ARN total. Deoarece miARN-urile reprezintă o fracțiune mică din repertoriul total de ARN, poate fi dificil să se determine contribuția acestora din analiza de integritate. Testul Qubit microARN oferă o detecție extrem de selectivă a unor cantități mici de ARN-uri mici, chiar și în prezența unor contaminanți obișnuiți. Procentaje ridicate de miARN-uri au fost detectate în mod obișnuit cu metodele de extracție miRVana și Norgen; cu toate acestea, având în vedere analiza de integritate pentru preparatele de ARN total Norgen, este posibil ca îmbogățirea miARN-urilor să fie supraestimată, deoarece fragmente mai mici de ARN sunt detectate în urma degradării sau oxidării ARN-urilor mai mari (ARNm, ARNr sau ARNt) sau, în cazul probelor pulmonare, contaminarea cu ADN care perturbă rezultatele Qubit. Prin urmare, cantitatea, calitatea și puritatea probelor de ARN sunt factori extrem de importanți pentru alegerea unei anumite metode de extracție a ARN-ului, iar cercetările ulterioare privind modul de optimizare a acestor metode pentru țesutul dumneavoastră de interes pot contribui la îmbunătățirea acestora.
Profilarea miARN-urilor poate oferi informații ca biomarkeri pentru aplicații de diagnostic sau prognostic. De exemplu, panourile de miARN-uri pot fi utilizate pentru a clasifica diferite fenotipuri de cancer, pentru a prezice recurența sau răspunsul la terapii . Cu toate acestea, pentru descoperirea și aplicarea clinică a biomarkerilor pe bază de miARN, este nevoie de practici optimizate și standardizate privind modul de extragere a ARN-ului, pentru a preveni rezultatele contradictorii. De exemplu, o meta-analiză a 63 de studii publicate de Zhou et al. (2014) a constatat rezultate inconsecvente și chiar contrastante atunci când a evaluat valoarea prognostică a oncomiR, miR-21 . Autorii atribuie eterogenitatea diferențelor în ceea ce privește sursa eșantioanelor, metodele de detectare și metodele de normalizare, dar nu au făcut aluzie la metodele de extragere a ARN-ului, la care arătăm că și noi contribuim.
Funcțiile biologice și țintele a foarte puțini miARN au fost validate experimental, dar acest lucru este esențial pentru a realiza potențialul terapiei bazate pe miARN. În plus, descoperirea funcțiilor biologice specifice țesuturilor va ajuta la identificarea acțiunii lor terapeutice și a potențialelor efecte în afara țintei în țesuturile normale. Validarea interacțiunilor miARN-ARNm se realizează în principal în teste de cultură celulară, care implică manipularea artificială a miARN-urilor endogene. Cu toate acestea, nivelurile obținute prin manipularea în culturile celulare (de exemplu, transfecția substanțelor mimice) nu sunt, de obicei, la nivelurile fiziologice observate in vivo, prin urmare, este important să se recapituleze rezultatele în modele animale adecvate. În prezent, niciun raport nu a comparat în mod direct detectarea miARN-urilor și a genelor țintă din probele de ARN total utilizând diferite metode de extracție. Noi arătăm că metodele de extracție a ARN-ului diferă în ceea ce privește eficiența lor în izolarea atât a ARN-ului scurt, cât și a celui lung și, prin urmare, trebuie să se acorde o atenție deosebită alegerii unei metode adecvate dacă se dorește detectarea ambelor din aceeași probă.
Cercetările anterioare au presupus în mod obișnuit că toate tipurile de ARN sunt purificate în mod egal. Cu toate acestea, au apărut mai multe rapoarte care indică diferențe în eficiența extracției în funcție de metoda utilizată pentru izolarea ARN-ului. Kim et al. (2011) și-au retras lucrarea din Molecular Cell deoarece au descoperit că concluziile lor privind diferențele de expresie a miARN din celulele cultivate la diferite confluențe (densitate mare față de densitate mică) și atunci când au fost detașate de pe vasul de cultură (aderente față de suspensie) au fost de fapt explicate de diferențele în eficiența extracției ARN folosind metoda TRIzol . Ei au descoperit că miARN-urile cu conținut scăzut de GC și structură secundară stabilă au fost pierdute în timpul extracției, în loc să fie degradate în celule, așa cum au publicat inițial . Rezultatele anterioare ale lui El-Khoury et al. (2016) au constatat diferențe în recuperarea miARN din celule, plasmă și exosomi derivați din urină/plasmă atunci când au comparat kiturile de extracție TRIzol LS, miRNeasy ser/plasmă și miRCURY biofluid . Autorii au constatat că kitul miRCURY a izolat ARN de înaltă puritate, dar a recuperat slab miARN, TRIzol a produs ARN de puritate scăzută care a avut un impact asupra eficienței PCR, în timp ce miRNeasy a produs ARN de calitate slabă, dar a avut cele mai bune rezultate în ceea ce privește detectarea miARN. De asemenea, McAlexander et al. (2013) au constatat diferențe în ceea ce privește extragerea miARN din plasmă și lichid cefalorahidian . Ei au comparat extracțiile miRVana, miRCURY Cell and Plant kit și TRIzol LS cu și fără glicogen ca suport. miRVana a fost similar cu sau fără glicogen, în timp ce miRCURY fără glicogen a avut o recuperare de miARN ușor mai mică decât miRVana. Cu toate acestea, glicogenul a îmbunătățit considerabil recuperarea miARN cu kitul miRCURY, dar a exacerbat randamentul scăzut și variabilitatea cu extracția TRIzol. Aceștia au comparat apoi kitul miRCURY Cell and Plant cu miRCURY Biofluids și cu metodele de extracție a serului/plasmei miRNeasy cu glicogen ca suport și au constatat că miRCURY Biofluids a avut cea mai mare abundență relativă de miARN exogen îmbogățit și au concluzionat că aceasta a fost metoda superioară pentru aplicația lor specifică. În mod colectiv, aceste studii evidențiază diferențele de recuperare a ARN folosind diferite metode de extracție și sugerează necesitatea de a optimiza pentru celula, țesutul și/sau fluidul dumneavoastră de interes.
Există mai multe etape în timpul fluxului de lucru care pot introduce variații experimentale. Începând cu metoda de fixare sau congelare a țesutului, depozitarea materialului, metoda de extracție a ARN, metoda utilizată pentru transcrierea inversă și amplificarea qPCR sau alte platforme din aval. În acest studiu am încercat să controlăm unele dintre aceste variabile prin congelarea rapidă a țesuturilor, depozitarea la – 80 °C, prevenirea decongelării înainte de extracție și utilizarea celor mai recomandate practici pentru analiza expresiei miARN. De exemplu, s-a demonstrat că utilizarea unor amorse RT specifice secvenței, spre deosebire de o amorsă RT universală, este superioară pentru amplificarea specifică a produsului . qPCR este considerată standardul de aur pentru analiza expresiei miARN-urilor și a țintelor datorită sensibilității și specificității sale față de platformele de profilare globală. Este important de remarcat faptul că calitatea rezultatelor obținute este mai importantă decât numărul pur și simplu de miARN-uri profilate de platformele mari bazate pe secvențiere. În plus, deși nu am comparat efectul îmbogățirii miARN din probele noastre de ARN, rapoartele anterioare ne-au sfătuit să nu o facem, în special în cazul platformelor de profilare globală a miARN. De exemplu, Redshaw et al. (2013) au constatat că procedura de îmbogățire a ARN scurt are ca rezultat niveluri relative de miARN semnificativ mai mici atunci când se compară ARN total și materialul îmbogățit, mai exact, procedura de îmbogățire a redus numărul de copii de miARN cu până la 25 % din cel prezent în probele preîmbogățite și că această pierdere a variat pentru diferite secvențe de miARN. Prin urmare, este posibil ca datele privind miARN din preparatele de ARN total și ARN scurt să nu fie direct comparabile. În plus, s-a sugerat că ARN-ul mai mare poate acționa ca un purtător pentru ARN-urile mici . Rămâne de stabilit dacă metodele îmbogățite cu miARN pentru toate societățile ar duce la o mai bună recuperare din țesuturi. Deși Bioline sugerează un kit separat pentru izolarea miARN, am utilizat kitul Isolate II pentru ARN total pentru a compara direct cu alte metode de extracție, deoarece kitul specific miARN nu permite izolarea atât a ARN scurt, cât și a ARN lung din aceeași eluzie. Mai degrabă, speciile de miARN sunt îmbogățite și izolate mai întâi, iar ARN-urile lungi pot fi extrase ulterior, rezultând două fracții separate. Deși Isolate II nu este optimizat pentru izolarea ARN-urilor mici, precum kiturile miRVana sau miRNeasy, acesta nu a fost superior nici în ceea ce privește expresia genei țintă. Având în vedere discrepanța mare dintre anumite kituri, cercetătorii ar trebui să opteze pentru o metodă de extracție mai robustă.
.