Cum funcționează cromatografia cu schimb de ioni?

Cromatografia prin schimb de ioni (IEX) este o tehnică utilizată în mod obișnuit în purificarea biomoleculelor. Aceasta implică separarea moleculelor pe baza încărcăturii lor.

Această tehnică exploatează interacțiunea dintre moleculele încărcate dintr-o probă și fracțiunile cu încărcătură opusă din faza staționară a matricei cromatografice. Acest tip de separare este dificil de realizat cu ajutorul altor tehnici, deoarece sarcina este ușor de manipulat prin pH-ul tamponului utilizat.

Sunt posibile două tipuri de separare prin schimb de ioni – schimb de cationi și schimb de anioni. În schimbul de anioni, faza staționară este încărcată pozitiv, în timp ce în schimbul de cationi este încărcată negativ.

Principiul cromatografiei prin schimb de ioni

Cromatografia prin schimb de ioni este utilizată în separarea biomoleculelor încărcate. Proba brută care conține molecule încărcate este utilizată ca fază lichidă. Atunci când trece prin coloana cromatografică, moleculele se leagă de situsurile cu sarcini opuse din faza staționară.

Moleculele separate pe baza încărcăturii lor sunt eluate cu ajutorul unei soluții de intensitate ionică variabilă. Prin trecerea unei astfel de soluții prin coloană, are loc o separare foarte selectivă a moleculelor în funcție de sarcinile lor diferite.

Tehnica

Etapele cheie ale procedurii de cromatografie cu schimb de ioni sunt enumerate mai jos:

• O probă proteică impură este încărcată în coloana de cromatografie cu schimb de ioni la un anumit pH.
• Proteinele încărcate se vor lega de grupele funcționale cu sarcină opusă din rășină
• Se folosește un gradient de sare pentru a elua proteinele separate. La concentrații scăzute de sare, proteinele care au puține grupe încărcate sunt eluate, iar la concentrații mai mari de sare, proteinele cu mai multe grupe încărcate sunt eluate.
• Proteinele nedorite și impuritățile sunt îndepărtate prin spălarea coloanei.

Un gradient de pH poate fi, de asemenea, aplicat pentru a elua proteine individuale pe baza punctului lor izoelectric (pI), adică punctul la care aminoacizii dintr-o proteină poartă sarcină neutră și, prin urmare, nu migrează într-un câmp electric. Deoarece aminoacizii sunt compuși ionici zwitter, aceștia conțin grupe care au atât sarcini pozitive, cât și negative. În funcție de pH-ul mediului, proteinele poartă o sarcină pozitivă, negativă sau nulă. La punctul lor izoelectric, acestea nu interacționează cu grupele încărcate din coloana de rășină și, prin urmare, sunt eluate. Un gradient de pH descrescător poate fi utilizat pentru a elua proteinele cu ajutorul unei rășini schimbătoare de anioni, iar un gradient de pH crescător poate fi utilizat pentru a elua proteinele din rășinile schimbătoare de cationi. Acest lucru se datorează faptului că creșterea pH-ului tampon al fazei mobile face ca proteina să devină mai puțin protonată (mai puțin încărcată pozitiv), astfel încât nu poate forma o interacțiune ionică cu rășina încărcată negativ, permițând astfel eluția. Invers, scăderea pH-ului fazei mobile va face ca molecula să devină mai protonată (mai puțin încărcată negativ_, permițând eluția sa.

Selecția de rășini în cromatografia cu schimb de ioni

Rășinile de schimb de ioni au grupări funcționale încărcate pozitiv sau negativ legate covalent de o matrice solidă. Matricile sunt de obicei realizate din celuloză, polistiren, agaroză și poliacrilamidă. Unii dintre factorii care afectează alegerea rășinii sunt schimbătorul de anioni sau de cationi, debitul, schimbătorul de ioni slab sau puternic, dimensiunea particulelor rășinii și capacitatea de legare. Stabilitatea proteinei de interes dictează selectarea unui schimbător de anioni sau de cationi – oricare dintre schimbători poate fi utilizat dacă stabilitatea nu reprezintă o preocupare.

Aplicațiile cromatografiei cu schimb de ioni

Schimbul de ioni este cea mai utilizată metodă cromatografică pentru separarea și purificarea biomoleculelor încărcate, cum ar fi polipeptidele, proteinele, polinucleotidele și acizii nucleici. Aplicabilitatea sa pe scară largă, capacitatea și simplitatea ridicată, precum și rezoluția sa înaltă sunt motivele principale ale succesului său ca metodă de separare. Cromatografia cu schimb de ioni este utilizată pe scară largă în mai multe aplicații industriale, dintre care unele sunt următoarele:

• Separarea și purificarea componentelor sanguine, cum ar fi albumina,factorii de creștere recombinanți și enzimele.
• Biotehnologie – Aplicații analitice cum ar fi controlul calității și monitorizarea proceselor
• Cercetare alimentară și clinică – pentru a studia soiurile de grâu și corelația proteinuriei cu diferite boli renale.
• Fermentare – Rășinile schimbătoare de cationi sunt folosite pentru a monitoriza procesul de fermentare în timpul producției de ß-galactosidază.

Lecturi suplimentare

• Toate conținuturile de cromatografie
• Cromatografie – Prezentare generală
• Aplicații ale cromatografiei în fază gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS)
• Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)
• Cromatografie lichidă-.Spectrometrie de masă (LC-MS) Aplicații