Citrobacter freundii fitness during bloodstream infection

Colecție de izolate Citrobacter BSI

În comparație cu alte specii Gram-negative care provoacă în mod regulat BSI, sunt disponibile informații limitate cu privire la fiziologia lui C. freundii în mediul gazdă. Cu scopul de a aborda acest neajuns, am colectat mai întâi opt izolate aparținând complexului C. freundii de la pacienți cu BSI din cadrul University of Michigan Health System. Filogenia bazată pe ARN ribozomal este capabilă să distingă trei grupuri de specii Citrobacter, dintre care grupul I cuprinde cel puțin opt specii și include C. freundii23,24. Cu toate acestea, abordările de identificare bazate pe secvența ARNr 16S și pe spectrometria de masă oferă o rezoluție filogenetică limitată în cadrul acestui grup de specii Citrobacter. Prin urmare, izolatele utilizate în acest studiu au fost evaluate în continuare cu ajutorul unei abordări de analiză a secvenței multilocus. Dintre cele opt izolate colectate, șase s-au grupat îndeaproape cu tulpini C. freundii stabilite (Fig. 1) și au avut o identitate nucleotidică medie de >98% cu tulpina tip ATCC 8090, care este peste pragul de 95% acceptat în mod obișnuit pentru izolatele din aceeași specie. Dintre cele două izolate rămase, UMH17 s-a grupat cel mai strâns cu tulpina tip Citrobacter pasteurii CIP 55.13 și UMH18 cu tulpinile Citrobacter werkmanii.

Bacteremia C. freundii

Principal pentru a investiga cerințele de fitness ale Citrobacter în timpul BSI, a fost dezvoltat un model murin de bacteremie pe baza unor lucrări anterioare cu alte specii enterice25. Dintre izolatele Citrobacter BSI, tulpinile UMH14 și UMH15 au fost alese drept candidate pentru a fi utilizate în acest studiu. Izolatul UMH14 a prezentat o colonizare mai consistentă, dependentă de doză, a splinei și a ficatului la 24 de ore după injectarea în vena cozii (Fig. S1) și a fost selectat pentru o caracterizare ulterioară. De asemenea, a fost necesar să se testeze modelul de infecție pentru potențialele blocaje de colonizare înainte de a evalua contribuția genelor individuale ale lui C. freundii la fitness folosind o colecție mare de mutanți transpozonici. A fost izolat un mutant spontan al UMH14 rezistent la acidul nalidixic (UMH14Nal) și s-a stabilit că are o fitness in vitro echivalentă în timpul co-culturii cu tulpina mamă în mediu bogat (Fig. S2). Pentru a determina dacă o populație diversă de mutanți ar putea fi stabilită în fluxul sanguin fără pierderea stocastică a clonelor individuale, tulpinile UMH14Nal și UMH14 au fost amestecate în proporții diferite și inoculate în șoareci. După 24 de ore, raporturi de până la 1:10 000 (UMH14Nal:UMH14) au fost tolerate fără pierderea spontană a tulpinii subreprezentate în splină (Fig. S2), ceea ce indică faptul că un singur șoarece ar putea găzdui cel puțin 10 000 de mutanți transpozonici unici la o doză totală de 5 × 107 bacterii folosind acest model.

Pentru a identifica genele de fitness Citrobacter în modelul de bacteriemie, cinci grupuri de mutanți de inserție de transpozon aleatorii reprezentând >44.000 de situsuri de inserție unice au fost injectate în șoareci, iar bacteriile care colonizau splina au fost recuperate după 24 de ore (Fig. S3). Abundența relativă a mutanților transpozonici individuali în inocul și în ieșirile splenice, așa cum a fost determinată prin secvențiere de mare randament, a fost utilizată pentru a identifica genele care contribuie la supraviețuirea bacteriilor în acest model. Un total de 177 de gene întrerupte de transpozon au conferit o pierdere semnificativă de fitness și nouă gene au fost asociate cu creșterea fitness-ului bacterian atunci când au suferit mutații (fold-change ≥2,0, Adj. P < 0,05) (Date S1). O a doua analiză cu acest set de date a identificat 546 de gene esențiale putative codificate cromozomial pentru care numărul de citiri în populația de intrare a fost semnificativ mai mic decât se aștepta pe baza site-urilor TA disponibile și a dimensiunii populației de bibliotecă (logFC <-5,17) (Date S2). Utilizând acest model de infecție oportunistă și sistemică, s-a anticipat că majoritatea factorilor de fitness identificați ar reprezenta mai degrabă procese fiziologice de bază decât factori de virulență prototipici (de exemplu, toxine proteice sau adezine). Într-adevăr, clasificarea celor 177 de gene asociate cu defecte semnificative de fitness prin grupuri de grupuri ortologice (COG) a reflectat predominanța căilor metabolice și a funcțiilor de întreținere celulară necesare în timpul bacteriemiei C. freundii (Fig. 2). Aproximativ jumătate dintre genele de fitness identificate se încadrează în linii mari în cinci categorii COG care cuprind producția de energie, metabolismul aminoacizilor, replicarea și repararea ADN-ului, traducerea și biogeneza peretelui celular și a membranei.

Validarea mutanților individuali ai genelor de fitness

Contribuția produselor genice individuale la fitnessul C. freundii a fost confirmată cu mutații independente de deleție-inserție construite în genele UMH14 selectate (tabelul 1). Toate tulpinile modificate raportate aici nu prezentau defecte grosiere de replicare, determinate prin creșterea în mediu bogat (Fig. S4). Pentru fiecare genă enumerată în tabelul 1, s-a măsurat fitness-ul prin coinfectarea mutanților individuali cu tulpina mamă UMH14. Cinci dintre cei șapte mutanți testați inițial au prezentat un dezavantaj competitiv semnificativ din punct de vedere statistic, fie în splină, fie în ficat (Fig. 3A), confirmând astfel rezultatele analizei transpozonice. Mutantul znuB a fost selectat ca martor negativ pentru validare în acest caz, deoarece rezultatele screening-ului transposonilor au indicat că această genă nu a fost asociată cu niciun defect de fitness, în ciuda dovezilor din alte specii bacteriene care demonstrează contribuția sistemului de transport al zincului ZnuABC la infecția murină26,27,28. În competiția cu UMH14, mutantul znuB nu a prezentat un defect de fitness semnificativ, în concordanță cu rezultatele așteptate. Genele adiacente znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) și znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) ale UMH14 nu au conferit, de asemenea, fie niciun defect de fitness, fie un defect minim atunci când au fost mutate prin inserție de transpozon (Date S1).

Mutația genei tatC, care codifică o componentă a sistemului de translocare a gemenilor cu arginină, a dus la cea mai mare pierdere de fitness dintre toți mutanții testați (Fig. 3). Pentru a determina dacă scăderea aptitudinii acestui mutant ar putea fi restabilită prin completare genetică, plasmidul pBBR1MCS-5 care adăpostește cadrul de citire deschis tatC a fost introdus în mutantul tatC și s-a testat aptitudinea relativă a tulpinii rezultate. Mutantul tatC a prezentat inițial un defect de fitness de 67 de ori mai mare în splină în competiție cu tulpina de tip sălbatic (Fig. 3A), în timp ce mutantul tatC completat a prezentat un defect de fitness de numai două ori mai mare în aceleași condiții (Fig. 3B). În mod similar, mutantul tatC completat nu a fost depășit în mod semnificativ de concurență în ficat în comparație cu UMH14. Se știe că plasmidul părinte pBBR1MCS-5 este menținut în mod stabil în timpul infecției în absența selecției29 , iar cultura in vitro a mutantului C. freundii tatC care adăpostește fie pBBR1MCS-5, fie plasmidul de completare tatC+ nu a demonstrat nicio pierdere apreciabilă de plasmidă timp de 24 de ore în absența selecției (Fig. S5). Împreună, aceste rezultate stabilesc cu fermitate cerința pentru funcția TatC în timpul bacteriemiei Citrobacter.

Conservarea genelor de fitness între izolatele Citrobacter

În cursul acestui studiu, a fost determinată secvența completă a genomului fiecărui izolat Citrobacter și proteomul prezis al fiecărei tulpini a fost comparat cu UMH14 ca referință. Dintre cei 4 666 de produse genetice prezise codificate pe cromozomul UMH14, 3 742 sunt conservate cu o identitate ≥95% între toate izolatele de C. freundii din acest studiu (Fig. 4A). Numărul de proteine conservate (≥95% identitate) între toate tulpinile scade la 2.545 atunci când au fost incluse proteomurile prezise ale UMH17 și UMH18, în concordanță cu plasarea acestor izolate în afara ramurii C. freundii prin analiza secvenței multilocus (Fig. 1). Conservarea factorilor de fitness UMH14 a fost, de asemenea, ridicată, cu 145 din cele 177 de proteine prezise conservate la ≥95% identitate de aminoacizi între cele opt tulpini de bacteriemie (Fig. 4B), inclusiv toți cei șapte factori de fitness inițiali care au fost selectați pentru validare (Tabelul 1 și Fig. 3). Eliminarea UMH17 și UMH18 din considerare a crescut numărul de factori de fitness conservați la 162 (92 %). Aceste rezultate sugerează o strategie de supraviețuire a Citrobacter în timpul bacteriemiei care depinde în mare măsură de proteinele conservate în cadrul speciei. Este interesant faptul că puțini factori de fitness au fost complet unici (<30% identitate) pentru UMH14 în cadrul acestui subset de tulpini. Un exemplu notabil este un operon putativ cu trei gene (CUC46_23440-CUC46_23450) cu defecte de fitness observate variind între 6 și 14 ori. Toate cele trei cadre de citire deschise codifică proteine ipotetice și, dintre acestea, doar CUC46_23450 se preconizează că codifică un domeniu conservat cu o funcție atribuită (cd01713, fosfoadenozin fosfosulfat reductază).

Cale de recombinare și reparare a ADN-ului

Unul dintre obiectivele acestui studiu a fost acela de a identifica căile biologice conservate care au implicat mai mulți factori de fitness de bacteriemie. Complexele enzimatice RecBCD și RuvABC care sunt implicate în recombinarea și repararea ADN-ului reprezintă un astfel de exemplu. Enzima RecBCD este activă la capetele de ADN duplex și este necesară pentru procesele de recombinare omoloagă și de reparare a ADN-ului prin recombinare. În legătură cu aceste funcții, enzima RuvABC facilitează migrarea și rezolvarea ramificațiilor joncțiunii Holliday30,31. Inserția transpozonului în recB, recC sau recD a dus la o reducere de 6-8 ori a fitness-ului și, în mod similar, întreruperea atât a ruvA, cât și a ruvC prin inserție de transpozon a dus la o pierdere de >30 de ori a fitness-ului (Date S1). Este important de menționat faptul că defectul de fitness al ruvA a fost confirmat prin infecția prin competiție împotriva tulpinii de tip sălbatic folosind un mutant construit independent (Fig. 3A). În cadrul celor două complexe multiproteice, doar RuvB nu a fost identificat ca fiind un factor de fitness semnificativ în setul nostru de date. Se știe că ambele complexe proteice participă la rezolvarea furcilor de replicare a ADN-ului blocate sau prăbușite care apar în timpul sintezei cromozomiale normale30, deși, fapt important, mutantul ruvA a crescut în mod similar cu tulpina de tip sălbatic în timpul replicării rapide în mediu bogat (Fig. S4). Este tentant să se speculeze că deteriorarea ADN-ului bacterian care are loc în mediul gazdă, potențial prin producerea de specii reactive de oxigen mediată de celulele imune, poate contribui, de asemenea, la cerința acestor complexe.

Sistemul de translocare a argininei gemene

Sistemul de translocare a argininei gemene funcționează la speciile bacteriene Gram-negative pentru a secreta proteine pliate prin membrana citoplasmatică. Rolul lui TatC în acest sistem multiproteic conservat este în recunoașterea secvențelor semnal de secreție pentru proteinele care sunt exportate prin această cale. După ce s-a stabilit impactul semnificativ al genei TatC asupra capacității in vivo a C. freundii (Fig. 3), s-a considerat că proteinele secretate de sistemul Tat pot fi, de asemenea, necesare pentru capacitatea de supraviețuire în modelul murin. Pentru a identifica proteinele putative secretate de Tat, secvența N-terminală a fiecăruia dintre cei 177 de factori de fitness a fost analizată cu ajutorul software-ului de predicție TatP 1.032. Două gene, CUC46_16565 și CUC46_1606060, au fost identificate ca fiind codificatoare de peptide de semnal dependente de Tat care conțin motive gemene de arginină. Produsul CUC46_16565 are o identitate aminoacidică de 94% cu proteina SufI din E. coli, inclusiv o conservare de 100% a motivului cu două arginine și a porțiunii hidrofobe a peptidei semnal33. Gena SufI din C. freundii a suferit o mutație și a fost evaluată în competiție cu tulpina mamă UMH14 pentru a determina dacă o parte din defectul de fitness asociat cu pierderea TatC ar putea fi atribuit întreruperii funcției SufI (Fig. 5A). Într-adevăr, tulpina mutantă sufI a fost depășită de 7 ori în splină și de 17 ori în ficat în comparație cu tulpina de tip sălbatic. Cu toate acestea, deoarece costul de fitness al mutației tatC a variat de la 67 la 112 ori în competiția cu bacteriile de tip sălbatic (Fig. 3), costul de fitness relativ scăzut al mutației sufI a implicat faptul că substraturile suplimentare dependente de Tat pot contribui, de asemenea, la fitness. Încercările de a stabili secreția dependentă de Tat a SufI în C. freundii nu au avut succes din cauza unor probleme de toxicitate aparentă asociate cu exprimarea unei construcții SufI cu etichetă epitelială C-terminală FLAG, în special în cadrul tulpinii mutante tatC (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, SufI a fost utilizată ca model de proteină secretată de Tat în numeroase studii de caracterizare a sistemului Tat din E. coli.

Cel de-al doilea potențial factor de fitness secretat de Tat care a fost identificat, codificat de CUC496_1606060, este o prolină aminopeptidază prezisă (PRK10879) aparținând superfamiliei PepP. O tulpină mutantă lipsită de gena pepP a fost depășită de aproximativ 3 ori în splină și de aproximativ 2 ori în ficat, dar dezavantajul de fitness observat în comparație cu tipul sălbatic nu a fost semnificativ din punct de vedere statistic (Fig. 5A). Cu toate acestea, localizarea subcelulară a PepP a fost determinată cu ajutorul unui derivat marcat cu epitopul C-terminal FLAG purtat pe o plasmidă multicopie (PepPFLAG). Niveluri neașteptat de scăzute de PepPFLAG au fost detectate în mutantul tatC în comparație cu UMH14; cu toate acestea, proteina de fuziune PepPFLAG a fost găsită în principal în fracțiunea citoplasmatică a ambelor tulpini testate (Fig. S6) și nu s-a obținut nicio dovadă pentru localizarea subcelulară dependentă de Tat a proteinei PepP. Împreună cu rezultatele infecției de competiție a mutantului sufI, aceste date susțin și mai mult ideea că în C. freundii sunt prezenți factori de fitness suplimentari dependenți de Tat sau că pierderea cumulativă a translocației proteinelor prin intermediul sistemului Tat depășește pierderea funcției pentru orice substrat unic.

Unul dintre fenotipurile predominante asociate cu mutanții tat cu pierdere de funcție în toate speciile este o afectare a motilității34,35,36,37. C. freundii este o bacterie flagelată capabilă de motilitate de înot într-o matrice de agar moale. Mutantul tatC din C. freundii a prezentat o reducere de aproximativ 2 ori a motilității de înot în comparație cu tulpina de tip sălbatic, iar motilitatea de înot a fost complet restabilită prin complementarea genetică în trans (Fig. 5B,C). Aceste rezultate demonstrează în mod clar un defect de motilitate în absența funcției TatC; cu toate acestea, din moment ce înotul de nivel scăzut a fost încă observat la mutantul tatC, este probabil că o anumită funcție flagelară este păstrată. Cu excepția lui fliQ, lipsa generală a genelor de fitness asociate flagelului identificate în timpul bacteriemiei sugerează că importanța lui tatC pentru fitnessul C. freundii poate fi în mare măsură independentă de disfuncția flagelului observată în această tulpină.

Cale de fitness metabolic

După cum s-a menționat anterior, o parte considerabilă a genelor de fitness identificate pentru Citrobacter au fost prezise să funcționeze în căile metabolice (Fig. 2). Trei gene diferite reprezentând componente ale metabolismului central al carbonului (pfkA), ale metabolismului fructozei și mannozei (mtlD) și ale biosintezei aminoacizilor (cysE) au fost alese pentru investigații suplimentare. Biosinteza bacteriană a cisteinei are loc din L-serină prin intermediarul O-acetil-L-serină (OAS). Această primă etapă din calea modelului E. coli este catalizată de enzima O-acetiltransferază CysE, iar pierderea cysE duce la o auxotrofie a cisteinei38,39. Un mutant C. freundii cysE este, de asemenea, incapabil să se reproducă într-un mediu definit lipsit de cisteină (Fig. 6A), dar poate atinge densități apropiate de cele de tip natural atunci când mediul a fost suplimentat fie cu OAS (Fig. 6B), fie cu cisteină (Fig. 6C). Complementarea genetică a mutației cysE a dus la restabilirea parțială a creșterii în absența cisteinei. Este interesant faptul că lipsa completă de creștere a bacteriilor mutante cysE în absența OAS sau a cisteinei in vitro este în contrast cu defectul parțial de fitness observat în timpul infecției (Fig. 3A). Acest lucru sugerează că Citrobacter poate fi capabilă să obțină acești metaboliți din mediul din fluxul sanguin, dar există totuși un cost de fitness asociat cu întreruperea căii de biosinteză.

Ca parte a investigației noastre privind metabolismul asociat cu gazda al Citrobacter, a fost investigată capacitatea acestei bacterii de a utiliza diferite surse de carbon. Enzima PfkA fosfofructokinază a altor specii enterice a fost caracterizată pe larg și reprezintă prima etapă angajată în glicoliză, catalizând fosforilarea fructozei-6-fosfat în fructoză-1,6-bisfosfat. În cazul UMH14, mutația pfkA a eliminat capacitatea acestei tulpini de a se replica pe glucoză ca unică sursă de carbon (Fig. 6D), care a putut fi parțial restabilită prin furnizarea de pfkA pe o plasmidă multicopie. Această pierdere totală a utilizării glucozei in vitro a fost corelată cu o scădere de două ori a capacității fizice în timpul bacteremiei (Fig. 3A). Deoarece glucoza este o sursă de carbon abundentă în serul mamiferelor40 , aceste rezultate sunt în concordanță cu rolul utilizării glucozei de către Citrobacter în timpul infecției, dar sugerează, de asemenea, că repertoriul metabolic al Citrobacter poate facilita utilizarea surselor alternative de carbon și energie.

Aceea de-a doua activitate enzimatică care implică fructoza-6-fosfat a fost, de asemenea, investigată pentru contribuții la bacteriemia Citrobacter. Proteina manitol-1-fosfat-5-dehidrogenază, MtlD, facilitează conversia bidirecțională a manitolului-1-fosfat și a fructozei-6-fosfat folosind NAD+ sau NADH ca și cofactor41,42. Mai multe specii de bacterii enterice pot utiliza alcoolul zaharat manitol ca sursă unică de carbon în urma transportului prin intermediul unui sistem de fosfotransferază dependentă de hexitol fosfoenolpiruvat, ceea ce duce la acumularea intracelulară de manitol-1-fosfat43,44. O posibilă soartă posibilă a manitol-1-fosfat este oxidarea dependentă de MtlD în fructoză-6-fosfat și canalizarea ulterioară în calea glicolitică. Mutantul C. freundii mtlD a prezentat o scădere de cinci ori a capacității de a se dezvolta în ficatul murin (Fig. 3A), iar această observație a determinat efectuarea de experimente pentru a determina dacă C. freundii este capabil de acest tip de metabolism in vitro. Tulpinile UMH14 și tulpinile derivate mtlD au fost cultivate în mediu definit care conține manitol, iar curbele de creștere rezultate demonstrează că bacteriile de tip sălbatic și mutantul completat au fost capabile să prolifereze în aceste condiții, în timp ce tulpina mtlD nu a putut (Fig. 6E). După cum era de așteptat, mutanta mtlD a fost capabilă să se reproducă la niveluri apropiate de cele de tip sălbatic atunci când a primit glucoză ca sursă de carbon în condiții aerobe (Fig. 6F). Împreună, aceste rezultate stabilesc atât capacitatea lui C. freundii de a utiliza manitolul ca sursă unică de carbon, cât și cerința pentru mtlD în acest proces.

Strategii de fitness împărtășite între agenții patogeni în mediul din fluxul sanguin

Am evaluat anterior cerințele de fitness ale unui alt agent patogen oportunist, S. marcescens, folosind un model murin similar de bacteremie. Rezultatele studiului privind S. marcescens au inclus identificarea a 212 gene de fitness folosind tehnici similare cu cele din prezenta lucrare45. În efortul de a determina dacă aceste specii împărtășesc căi comune pentru fitness în timpul BSI, proteomii prezise ale celor două specii au fost mai întâi comparate. Proteinele au fost considerate omologi între C. freundii și S. marcescens dacă au avut o identitate de aminoacizi ≥70% pe ≥50% din secvență. În total, 42 de proteine omoloage au fost identificate ca factori de fitness semnificativi în ambele organisme (tabelul S1), o serie de funcții diverse fiind reprezentate în această listă de factori de fitness comuni. În special, proteina RuvA, a cărei pierdere a dus la o scădere de >10 ori a fitness-ului C. freundii prin infecție prin competiție (Fig. 3A), a fost identificată împreună cu RuvC ca factori de fitness în S. marcescens. Aceste rezultate susțin în continuare ipoteza conform căreia rezolvarea complexelor de joncțiune Holliday, potențial în timpul reparării recombinaționale a leziunilor ADN, este importantă pentru fitnessul in vivo al acestor organisme. Enzima PfkA fosfofructokinază a fost, de asemenea, identificată ca factor de fitness la ambele specii. Așa cum s-a observat în cazul Citrobacter, S. marcescens pfkA este necesară pentru utilizarea glucozei ca sursă unică de carbon și, în plus, a fost necesară pentru o replicare bacteriană optimă în serul uman inactivat termic45. La ambele organisme, pfkA a contribuit la fitness în splină, așa cum a fost evaluat prin screeningul transpozonilor, deși, în mod interesant, mutantul S. marcescens pfkA a prezentat, de asemenea, un fitness redus de aproximativ 9 ori în rinichi prin infecția prin competiție cu tulpina de tip sălbatic. În cursul acestei lucrări, s-a observat că tulpina de tip sălbatic C. freundii UMH14 a prezentat o colonizare relativ slabă a rinichiului în modelul BSI, dar s-a demonstrat că gena pfkA a Proteus mirabilis contribuie la capacitatea de funcționare a rinichiului în urma unei infecții a tractului urinar46. Împreună, aceste rezultate demonstrează fezabilitatea identificării strategiilor de fitness conservate între organisme într-un mediu specific. Vor fi necesare lucrări suplimentare pentru a determina dacă acești produși genetici sunt, de asemenea, necesari la alte organisme care cauzează BSI și dacă aceste căi conservate de fitness pot fi exploatate.

.