Produse chimice și reactivi
GT a fost achiziționat de pe piața din Taichung, Taiwan. IS (puritate 97%) a fost obținut de la Alfa Aesar (Lancaster, Regatul Unit). 6,7-dimetoxicoumarina (6,7-DMC, puritate 98%) a fost furnizată de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, S.U.A.). EC (puritate 90 %), ECG (puritate 98 %), EGCG (puritate 95 %), acid formic, probenecid, acid fosforic (glacial, 85 %) și metil-paraben au fost achiziționate de la Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, S.U.A.). EGC (puritate 92,7%) a fost obținută de la ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, S.U.A.). și acetatul de etil au fost de calitate LC și au fost obținute de la ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Acetonitrilul a fost de calitate LC/MS și a fost achiziționat de la Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, S.U.A.). Serul fetal de bovine a fost obținut de la Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicilină-Streptomicină-Glutamină, Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, tripsină/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution și acidul 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinethanesulfonic au fost achiziționate de la Invitrogen (Carlsbad, CA, S.U.A.). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 a fost obținut de la Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, S.U.A.). 6-Carboxifluoresceina a fost achiziționată de la AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, S.U.A.), iar 5-carboxifluoresceina a fost obținută de la Acros Organics (Geel, Belgia). Pentru toate preparatele s-a folosit apă Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, S.U.A.).
Prepararea și caracterizarea infuziei de GT
Infuzia a fost produsă prin macerarea a 2 sau 4 g de GT în 50 ml de apă deionizată fierbinte (98-100 °C) timp de 30 min. Infuzia a fost filtrată cu tifon în timp ce era fierbinte pentru a obține concentrații de 40 și, respectiv, 80 mg/mL, care au fost administrate proaspăt la șobolani prin gavare gastrică.
Pentru caracterizarea infuziei de GT, după filtrarea infuziei de GT cu un filtru RC15 de 0,2 μm (Sartorious, Goettingen Germania), 100 μL de filtrat au fost amestecate cu 900 μL de metanol și centrifugate pentru a elimina precipitatul. Infuzia diluată corespunzător (50 μL) a fost combinată cu 50 μL de soluție de 6,7-DMC (2,0 μg/mL în metanol) ca standard intern, iar 5 μL au fost supuse analizei LC-MS/MS. Sistemul HPLC a inclus pompa Accela 1250 și auto-samplerul (Thermo Fisher Scientific Inc. S.U.A.). Separarea cromatografică s-a realizat cu ajutorul unei coloane analitice Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) cu un prefiltru. Faza mobilă a fost compusă din acetonitril cu 0,01% acid formic (A) și apă cu 0,01% acid formic (B) și a fost programată în gradient, după cum urmează: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) și 2/98 (12 min). Debitul a fost de 0,2 ml/min. Efluentul coloanei a fost detectat prin sonda H-ESI (ionizare prin electrospray încălzită) -II cu spectrometrul de masă Quantum Access MAX cu triplu etaj cvadrupol (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. S.U.A.). Azotul a fost utilizat ca gaz de înveliș la 35 unități arbitrare și gaz auxiliar la 10 unități arbitrare. Energia de coliziune a fost setată la -19/18 V, tensiunea de pulverizare la -3000/3000 V, temperatura capilarului la 350 °C, temperatura vaporizatorului la 350 °C și decalajul lentilei tubului la -80/88 V. Următoarele tranziții de masă au fost utilizate pentru analiza de monitorizare a reacțiilor selectate (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) și 6,7-DMC (207/151). Spectrele ESI-MS au fost înregistrate în modul de ioni negativi pentru EC, EGC, ECG și EGCG și în modul de ioni pozitivi pentru 6,7-DMC.
Animale
Șobolani Sprague-Dawley masculi (270-360 g) au fost achiziționați de la Centrul Național pentru Animale de Laborator (Taipei, Taiwan) și adăpostiți în mediu condiționat cu cicluri de 12 ore lumină/întuneric. Hrana și apa au fost achiziționate ad libitum până la 12 h înainte de experimente. Șobolanii au fost împărțiți în două grupuri. Primul experiment a utilizat 28 de șobolani pentru a determina efectul GT asupra nivelurilor serice de IS și PCS la șobolanii CRF; al doilea experiment a utilizat 14 șobolani pentru a evalua efectul GT asupra funcției renale a șobolanilor CRF. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în strictă conformitate cu recomandările din ”Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (2002)” publicat de Societatea chineză de zootehnie, Taiwan, R.O.C. Protocolul experimental a fost revizuit și aprobat la data de 08/01/2014 (Numărul permisului: 103-126-N) de către Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea de Medicină din China, Taiwan, R.O.C.
Stabilirea modelului CRF și administrarea perfuziei de GT
CRF a fost indusă prin administrarea orală de adenină în urma unor studii anterioare, dar cu unele modificări19,23,35,36. Pe scurt, adenina suspendată în 0,5 % metilceluloză 400 (15 mg/mL) a fost administrată pe cale orală la 28 de șobolani prin gavare gastrică de două ori pe zi, pentru șapte doze consecutive (15 mg/rat) pe toată durata perioadei experimentale. În ziua 4, au fost determinate nivelurile serice de IS. La confirmarea atenuării funcției renale prin creșterea semnificativă a nivelurilor serice de IS, șobolanii CRF au fost împărțiți în trei grupuri (8-10 șobolani în fiecare grup) cu niveluri comparabile de IS. Primul grup a primit 400 mg/5 ml/kg de perfuzie de GT de două ori pe zi, timp de șapte doze consecutive; al doilea grup a primit 200 mg/5 ml/kg de GT de două ori pe zi, timp de șapte doze consecutive; iar al treilea grup a primit în paralel 5 ml/kg de apă ca martor. În ziua 8, șobolanilor li s-a administrat a 7-a doză de GT la ora 9:00 dimineața, după postul de peste zi, iar probele de sânge au fost recoltate la 0, 15, 15, 30, 30, 60, 120, 180 și 360 min după administrarea dozei. Timpul programat de recoltare a sângelui și administrările de adenină și GT sunt rezumate în Fig. 3. La fiecare moment de prelevare a probelor, s-au prelevat 0,5 ml de sânge sub anestezie cu izofluran. Probele de sânge au fost colectate în microtuburi și centrifugate la 10.000 g timp de 15 min pentru a obține ser, care a fost depozitat la -20 °C înainte de analiză.
Determinarea concentrațiilor de IS și PCS în ser
Pentru determinarea concentrațiilor de IS și PCS în ser, 50 μL de probă de ser au fost vortexate cu 200 μL de metanol care conținea 10 μg/mL de 6,7-DMC sau, respectiv, 100 μg/mL de metilparaben ca standarde interne și centrifugate pentru a elimina precipitatul, apoi o alicotă de 20 μL a fost supusă analizei HPLC.
Pentru preparatele de calibrare, 50 μL de ser au fost îmbogățite cu o serie de concentrații de IS și PCS pentru a permite intervale de concentrație de 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) și, respectiv, 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM). Procedura ulterioară a urmat-o pe cea descrisă mai sus pentru probele de ser. Curbele de calibrare au fost trasate prin regresia liniară a rapoartelor suprafețelor de vârf (IS sau PCS față de standardul intern) față de concentrațiile cunoscute de IS și, respectiv, PCS.
Aparatura HPLC a inclus o pompă (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japonia), un detector de fluorescență (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japonia) și un injector automat (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japonia). Coloana Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, SUA) a fost echipată cu o coloană de gardă (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japonia). Faza mobilă a constat din acetonitril (A)-0,1 % acid fosforic (B) și a fost programată în mod gradient, după cum urmează: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) și 15/85 (24-35 min) pentru IS și 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) și 16/84 (24-36 min) pentru PCS. Setările detectorului au fost Ex 280 nm/Em 375 nm pentru IS și Ex 214 nm/Em 306 nm pentru PCS. Debitele au fost de 1,0 ml/min.
Efectul GT asupra Cr și BUN la șobolanii CRF
Într-un alt experiment, a fost utilizat același protocol pentru animale menționat mai sus, iar concentrațiile de Cr și BUN au fost determinate înainte de tratamentul cu adenină (Ziua 0), înainte de administrarea de GT (Ziua 4) și după a 7-a doză de GT (Ziua 8). După confirmarea atenuării funcției renale prin creșterea semnificativă a Cr și BUN în ziua 4, șobolanii CRF au fost împărțiți în două grupuri (7 șobolani pe grup) cu niveluri comparabile de Cr. Primul grup a primit 400 mg/5 ml/kg de GT de două ori pe zi, timp de șapte doze consecutive; al doilea grup a primit în paralel 5 ml/kg de apă ca martor. În ziua 8, șobolanilor li s-a administrat a 7-a doză de GT și apă după postul de peste zi, iar probele de sânge au fost recoltate 30 de minute mai târziu. Cr a fost determinat prin metoda cinetică a picratului alcalin într-un sistem ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, S.U.A.). BUN a fost determinat prin reacția enzimatică cuplată urează/glutamat dehidrogenază utilizând același analizor.
Liniile celulare și condițiile de cultură
Construcția liniilor celulare transfectate în mod stabil utilizate pentru studiile de transport, celule de ovar de hamster chinezesc (CHO) care exprimă hOAT1 (CHO-hOAT1), celule de rinichi embrionar uman 293 (HEK) care exprimă hOAT3 (HEK-hOAT3) și liniile celulare de control corespunzătoare transfectate cu vectorul gol, a fost descrisă anterior40,41. Celulele CHO au fost menținute la 37 °C cu 5% CO2 în mediu DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., SUA) care conține 10% ser, 1% penicilină/streptomicină și 1 mg/mL G418. Celulele HEK au fost menținute la 37 °C cu 5% CO2 în mediu DMEM cu conținut ridicat de glucoză (Thermo Fisher Scientific Inc., SUA), SUA) conținând 10% ser, 1% penicilină/streptomicină și 50 μg/mL higromicină B. Celulele au fost cultivate în farfurii acoperite cu Poly-D-Lysine.
Prepararea și caracterizarea metaboliților serici ai GT (GTM)
Pentru a imita moleculele care interacționează cu OAT in vivo, GTM au fost preparate de la șobolani și caracterizate. Pe scurt, perfuzia de GT (800 mg/10 ml/kg) a fost administrată pe cale orală la șobolani aflați la post peste noapte. Sângele a fost recoltat la 15 minute după administrarea perfuziei de GT. După coagulare, serul a fost colectat și vortexat cu 3 ori metanol. În urma centrifugării la 10 000 g timp de 15 minute, supernatantul a fost concentrat într-un evaporator rotativ în vid până la uscare. La reziduu s-a adăugat un volum corespunzător de apă, obținându-se o soluție cu o concentrație de 10 ori mai mare decât cea a serului, care a fost împărțită în alicote și depozitată la -80 °C pentru utilizare ulterioară.
O porțiune de GTM a fost caracterizată după o metodă anterioară cu unele modificări16,46. Pe scurt, 100 μL de probă de ser au fost amestecate cu 50 μL de sulfatază (conținând 1000 unități/mL de sulfatază și 39,861 unități/ml de ß-glucuronidază), 50 μL de acid ascorbic (200 mg/mL) și incubate la 37 °C timp de 45 min în condiții anaerobe. După hidroliză, serul a fost adăugat la 50 μL de HCl 0,1 N și apoi divizat cu 250 μL de acetat de etil (conținând 100 ng/mL de 6,7-DMC ca standard intern). Stratul de acetat de etil a fost evaporat sub N2 până la uscare și reconstituit cu un volum corespunzător de fază mobilă înainte de analiza LC-MS/MS. Faza mobilă a constat din acetonitril (A) – apă conținând 0,1 % acid formic (B) și a fost programată în mod gradient, după cum urmează: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) și 2/98 (12 min). Debitul a fost de 0,2 ml/min.
Efectele GTM asupra transportului de absorbție mediat de hOAT1 și hOAT3
Celele CHO-hOAT1 și HEK-hOAT3 (1 × 105 celule/poț) au fost cultivate într-o placă cu 96 de godeuri. 6-carboxifluoresceina (6-CF) și 5-carboxifluoresceina (5-CF) au fost utilizate ca sonde pentru evaluarea efectului GTM asupra activității hOAT1 și, respectiv, hOAT347,48. În plus, probenecidul (80 μM) a fost utilizat ca un control pozitiv pentru inhibarea hOAT1 și hOAT349. După 24 h sau 48 h de incubare a CHO-hOAT1 sau HEK-hOAT3, mediul a fost îndepărtat și spălat de trei ori cu tampon PBS. Înainte de experimentul de transport, celulele CHO-hOAT1 și HEK-hOAT3 au fost preincubate cu agenții de testare (GTM și probenecid) la 37 °C. După 30 de minute de incubație, s-a adăugat 6-CF sau 5-CF și s-a incubat timp de încă 5 minute și, respectiv, 10 minute. Plăcile au fost plasate imediat pe baie de gheață, iar supernatantele au fost îndepărtate și celulele au fost spălate de trei ori cu PBS rece ca gheața. Ulterior, s-au adăugat 100 μl de Triton X-100 0,1% pentru a liza celulele, iar fluorescența a fost măsurată prin excitare la 485 nm și emisie la 528 nm. Pentru a cuantifica conținutul de proteine din fiecare fântână, 10 μL de lizat celular au fost adăugate la 200 μL de reactiv de testare a proteinelor diluat (Bio-Rad, Hercules, CA, S.U.A.), iar densitatea optică a fost măsurată la 570 nm. Acumularea intracelulară relativă de 6-CF sau 5-CF a fost calculată prin comparație cu cea a martorilor după corecția proteinelor.
Analiza datelor
Concentrația serică maximă (Cmax) a fost obținută din observația experimentală. Aria sub curba concentrație serică – timp (AUC0-t) a fost calculată folosind regula trapezoidală până la ultimul punct. Diferențele de IS și PCS între cele trei grupuri au fost analizate prin utilizarea ANOVA cu o singură cale, în timp ce diferența de Cr și BUN între două grupuri a fost analizată prin utilizarea testului t al lui Student nepereche, luând p < 0,05 ca nivel semnificativ. Testul t al lui Student neperecheat a fost utilizat, de asemenea, pentru analiza testelor in vitro.