Boala Albers-Schönberg (osteopetroză autozomal dominantă, tip II) rezultă din mutații în gena canalului de clorură ClCN7

Abstract

Boala Albers-Schönberg, sau osteopetroza autosomal dominantă, tip II (ADO II), este cea mai frecventă formă de osteopetroză, un grup de afecțiuni caracterizate de o masă scheletică crescută datorată unei resorbții osoase și cartilaginoase deficitare. Ca urmare a atribuirii genei care cauzează ADO II la cromozomul 16p13.3, noi raportăm acum șapte mutații diferite în gena care codifică canalul de clorură ClCN7 în toate cele 12 familii ADO II analizate. În plus, a fost identificat un pacient cu forma severă, autozomal recesivă, infantilă de osteopetroză (ARO), care este homozigot pentru o mutație ClCN7. Din corelațiile genotip-fenotip, se pare că ADO II reflectă un efect negativ dominant, în timp ce mutațiile de pierdere a funcției în ClCN7 nu provoacă anomalii la persoanele heterozigote. Deoarece unii pacienți cu ARO au mutații în ambele copii ale genei ClCN7, ADO II este alelică la un subset de cazuri de ARO.

Recepționat la 2 octombrie 2001; Revizuit și acceptat la 11 octombrie 2001.

INTRODUCERE

În condiții de sănătate, remodelarea țesutului osos rezultă din procesele echilibrate de formare și resorbție osoasă. Resorbția excesivă determină osteoporoza, care este responsabilă de majoritatea fracturilor netraumatice (1). În schimb, resorbția osoasă defectuoasă determină osteopetroza, caracterizată prin oase dense, dar de obicei fragile. Cel puțin opt tipuri de osteopetroză au fost descrise la om (2). Deficiența izoenzimei anhidrazei carbonice II determină osteopetroza autosomal recesivă (ARO) cu acidoză tubulară renală și calcificări cerebrale (3; MIM 259730), în timp ce majoritatea cazurilor de ARO malignă (4; MIM 259700) reflectă mutații în gena TCIRG1 (5,6). Unele cazuri rare de osteopetroză, aparent cu un mod de moștenire autozomal recesiv, prezintă un fenotip mai blând și, prin urmare, sunt denumite forma „intermediară” (7,8; MIM 259710).

Osteopetroza autozomal dominantă (ADO) este mult mai frecventă decât omologii săi recesivi (9). Cu toate acestea, din cauza tabloului său clinic relativ benign, mulți pacienți fiind asimptomatici și depistați doar prin examinare radiografică întâmplătoare, prevalența ADO este subestimată. În rândul familiilor cu ADO, se raportează în general două subtipuri bazate în principal pe caracteristicile radiografice (10,11). Tipul I (ADOI) prezintă o osteoscleroză generalizată, difuză, care afectează în special bolta craniană (11). Tipul II (ADO II; MIM 166600), forma descrisă inițial în 1904 de Albers-Schönberg (12), este cea mai frecventă formă, cu o prevalență estimată de până la 5,5/100 000 (13). Manifestările clinice includ fracturi netraumatice, în special ale oaselor lungi, paralizii ale nervilor cranieni, osteoartrită a șoldului și osteomielită mandibulară (14). ADO II se manifestă radiografic cu o osteoscleroză segmentară, predominant la nivelul plăcilor terminale vertebrale (coloana vertebrală „rugger jersey”), aripile iliace (semnul „os în os”) și baza craniului (9) (Fig. 1).

Recent, o căutare la nivelul întregului genom ne-a condus la atribuirea unei gene care stă la baza ADO II la cromozomul 16p13.3 (15). În mod interesant, gena care codifică canalul de clorură ClCN7 se află în regiunea candidată de 8,4 cM (16). De fapt, canalul de clorură este esențial pentru acidificarea lacunei de resorbție extracelulară necesară pentru degradarea țesutului osos mediată de osteoclaste (17) și este mutantă la un pacient cu ARO (17). Prin urmare, am considerat ClCN7 atât o genă candidată pozițională, cât și funcțională pentru cauzarea bolii Albers-Schönberg.

REZULTATE

Analiza mutațiilor în familiile ADO II

Pentru că secvența genomică ce include gena ClCN7 este disponibilă în bazele de date de secvențe (nr. de acces GenBank AL031600 și AL031705), analiza mutațiilor exonilor și a limitelor intron-exon este posibilă folosind ADN genomic. Acest efort a scos la iveală șapte mutații distinctive în ClCN7 (Fig. 2) în 12 familii de ADO II fără legătură între ele (Tabelul 1). Cinci mutații sunt de tip missense, una are ca rezultat o deleție de un aminoacid și una delețiază două nucleotide, cauzând o deplasare de cadru care afectează capătul C-terminal al proteinei. Niciuna dintre aceste mutații nu a fost găsită în 100 de cromozomi de control.

Patru mutații sunt mutații redundante. Mutația 2423delAG a fost identificată la o familie din Franța și la o familie americană. Mutația G215R a apărut într-o familie franceză, una daneză și una americană. Mutația P249L a fost identificată într-o familie franceză și într-o familie germană. În cele din urmă, mutația R767W a fost identificată într-o familie franceză și într-o familie americană (tabelul 1). Originile geografice diferite ale familiilor studiate, precum și analiza markerilor microsateliți care flanchează gena ClCN7 (datele nu sunt prezentate), indică faptul că acestea sunt mutații independente, adică nu sunt moștenite de la un strămoș comun.

Analiza mutațiilor unui pacient ARO

Analiza de linkage cu markeri de pe cromozomul 16p13.3 a arătat clar homozigozitatea pentru toți markerii la un pacient ARO născut din părinți consangvini, sănătoși (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, a fost efectuată o analiză a mutației ClCN7 care a demonstrat o mutație homozigotă missense la poziția 766 (L766P) (Fig. 2). Ambii părinți sunt heterozigoți pentru această mutație.

Poziția și conservarea aminoacizilor mutați

Topologia transmembranară propusă pentru canalele de clorură ClC sugerează 10-12 domenii transmembranare (18). Cei cinci aminoacizi implicați în mutațiile missense ADO II, precum și în mutația implicată în cazul pacientului ARO, sunt toți foarte bine conservați în rândul diferiților membri ai familiei de gene ale canalelor de clorură ClC (Fig. 3). Mutațiile G215R și P249L sunt mutații recurente găsite la pacienții din trei și, respectiv, două familii neînrudite (tabelul 1). G215 este un reziduu foarte conservat, situat între D2 și D3 (Fig. 4), o regiune cunoscută pentru faptul că influențează proprietățile porului canalelor (19), în timp ce P249 participă la un element structural foarte conservat, care formează o parte substanțială a porului canalului ClC (20). R286 este localizat în spațiul extracelular, chiar în afara domeniului transmembranar D5. Acest aminoacid este conservat între diferitele proteine ClC, cu excepția ClC1 și ClC2, care au o secvență divergentă în această regiune a proteinei. Cele două mutații ADO II rămase și mutația ARO se află în partea citosolică, C-terminală a proteinei, implicând aminoacizi învecinați. G765, L766 și R767 sunt localizați în cadrul secțiunii D13, care coincide cu cel de-al doilea domeniu CBS (cistationină-β-sintetază) descris în proteina CLCN7 (21). Toate cele trei mutații se localizează în interiorul catenei β2 a domeniului CBS în care au fost raportate mutații care provoacă boli umane (22). Funcția precisă a acestui domeniu este încă neclară, dar a fost sugerat un rol în sortarea proteinelor (21).

În cele din urmă, cele două mici deleții implică aminoacizi din partea intracelulară C-terminală a ClCN7. Aminoacidul L688, deletat la un pacient, este situat între cele două domenii CBS, în timp ce deleția a două nucleotide începând de la poziția nucleotidică 2423 are ca rezultat, la două familii neînrudite, o proteină care diferă de ClCN7 de tip sălbatic doar în ultimii 10 aminoacizi.

DISCUȚII

Osteopetrozele la mamifere cuprind un grup eterogen de afecțiuni, incluzând cel puțin opt entități clinice diferite la om (2) și aproximativ nouă mutanți spontani la animale (23). Mai mult, modelele de șoareci knockout pentru mai multe gene cauzează fenotipuri osteopetrotice, ilustrând diversitatea factorilor implicați în diferențierea și activarea osteoclastelor (23).

Recent, eterogenitatea pentru osteopetrozele umane a fost subliniată de eterogenitatea genetică chiar și în cadrul subtipului ADO II (24,25). Această revelație s-a bazat pe un studiu de legătură care a implicat o familie daneză extinsă, care a atribuit gena ADO II la cromozomul 1p21 (26). Cu toate acestea, această atribuire nu a fost confirmată în studiile altor familii cu ADO II. De fapt, în studiul nostru recent de linkage, care a inclus șase familii cu ADO II, am localizat gena care cauzează boala pe cromozomul 16p13.3 și am descoperit în aceeași familie daneză cosegregare între ADO II și un haplotip al cromozomului 16p13.3 (15). Prin urmare, am speculat că dovezile de legătură cu cromozomul 1p21 în această familie reflectă o cosegregare accidentală. În acest studiu actual, am confirmat această ipoteză prin identificarea unei mutații care cauzează boala (G215R) în gena ClCN7 în această familie daneză. Acest lucru, și faptul că mutații în această genă au fost găsite în toate cele 12 familii ADO II analizate, sugerează că ADO II este omogenă din punct de vedere genetic.

Rezultatele noastre ilustrează, de asemenea, că ADO II este alelică cu un subset de pacienți cu forma severă, autosomal recesivă, infantilă de osteopetroză. Anterior, un pacient ARO a fost descris ca un heterozigot compus pentru o mutație fără sens (Q555X) și o mutație cu sens greșit (R762Q) în gena ClCN7 (17). Acum găsim o mutație homozigotă (L766P) la un alt pacient ARO.

Figura 5 ilustrează corelația noastră între diferitele genotipuri și fenotipuri. După cum demonstrează fenotipul șoarecelui ClC-7 knockout, pierderea completă a funcției canalului de clorură ClC-7 provoacă osteopetroză severă, așa cum se observă la pacienții ARO. Deoarece mutațiile ClCN7 au fost caracterizate până în prezent doar la doi pacienți ARO, este imposibil de știut dacă orice diferențe fenotipice reflectă natura mutațiilor lor. Unele cazuri rare de osteopetroză au o formă „intermediară”. În aceste cazuri, se propune un mod de moștenire autosomal recesiv, dar fenotipul este mai blând decât în cazul ARO (7,8). Poate că aceste cazuri se datorează combinațiilor a două mutații în ClCN7 care reduc fiecare doar ușor capacitatea de conductanță a Cl-.

Mutațiile ADO II raportate aici sunt în principal mutații missense care implică aminoacizi conservați (figurile 3 și 4). Cele două mutații rămase sunt mici deleții care păstrează, de asemenea, anatomia majoră a canalului de clorură și, prin urmare, cel mai probabil au ca rezultat efecte comparabile cu mutațiile missense. Deoarece canalele de clorură par a fi organizate sub formă de multimeri, probabil dimeri (27), aceste mutații le afectează probabil funcția datorită unor efecte negative dominante. Cu astfel de efecte, majoritatea canalelor de clorură nu vor funcționa, explicând anomaliile fenotipice.

În general, părinții pacienților cu ARO sunt normali din punct de vedere fenotipic. Presupunem că acest lucru reflectă faptul că haploinsuficiența pentru această genă cel mai probabil nu provoacă complicații clinice sau constatări radiografice. Alternativ, în unele cazuri, acest lucru se poate datora penetranței reduse a ADO II. Părinții pacientului cu ARO prezentat în acest studiu nu prezintă simptome clinice de ADO II, dar nu a fost disponibil un studiu radiografic.

Natura alelică a ADO II și ARO este susținută de un raport al unei familii extinse care segregă ADO II în care un individ a manifestat ARO (28). Poate că în această familie o mutație a genei ClCN7 cu efect negativ dominant cauzează ADO II care apoi coincide cu o mutație de novo, sau o mutație moștenită de la cel de-al doilea părinte care cauzează ARO. Explicația propusă pentru ambele forme dominante și recesive de osteopetroză asociate cu mutațiile ClCN7 este paralelă cu mutațiile din gena ClC-1 care cauzează miotonie. Mutațiile care au ca rezultat pierderea ClC-1 cauzează forma autosomală, recesivă (tip Becker) (29), în timp ce mutațiile missense se manifestă cu forma mai puțin severă, autosomală dominantă (tip Thomsen) (30).

În concluzie, arătăm că majoritatea, dacă nu toate cazurile de ADO II sunt cauzate de mutații în gena ClCN7. Pe baza naturii mutațiilor ClCN7, fenotipul ADO II rezultă, probabil, dintr-un efect dominant negativ. Descoperirile noastre susțin ipoteza conform căreia canalele de clorură acționează în general ca homomultimeri. Mai mult, studiul nostru ilustrează natura alelică a ADO II și un subset de cazuri ARO.

MATERIALE ȘI METODE

Familii și pacienți

Familiile A-F au fost descrise anterior, deoarece au fost folosite pentru a localiza gena bolii Albers-Schönberg pe cromozomul 16p13.3 (15). Probele G-L provin de la indivizi afectați din familii cu antecedente de boală Albers-Schönberg și mai multe au fost, de asemenea, descrise (31-33) (tabelul 1).

Familia M locuiește în Statele Unite, dar este de origine chineză. Propusa este copilul unui cuplu sănătos și s-a născut după o gestație la termen. Părinții sunt verișori de gradul doi. ARO a fost diagnosticată la vârsta de 3 luni, când s-a prezentat la New York Hospital Medical Center of Queens cu paralizie Bell. Studiul radiografic al scheletului a evidențiat osteopetroză severă și mai multe fracturi oblice nedeplasate. Avea anemie, reticulocitoză, hepatosplenomegalie și atrofie ușoară a nervului optic. Copilul a fost supus unui transplant de măduvă alogenă nepotrivită, dar a murit la vârsta de 18 luni din cauza septicemiei și insuficienței respiratorii.

Analiza mutațiilor

ADN-ul a fost izolat din sânge prin proceduri standard. Amorsele intronice (tabelul 2), care amplifică toți exonii codificatori și limitele intron-exonice ale ClCN7, au fost proiectate din secvențe genomice (nr. de acces GenBank AL031600 și AL031705). Cei 25 de exoni au fost amplificați din ADN genomic Taq-polimerase sau cu sistemul PCR enhancer (Gibco BRL), cu o concentrație de enhancer 1×. Pentru toate amplificările, s-au efectuat 30 de cicluri la o temperatură specificată în tabelul 2.

Produsele PCR au fost purificate cu sistemul de purificare Concert Rapid PCR (Life Technologies) și secvențiate direct cu amorsele utilizate pentru amplificare, utilizând chimia de terminare Big-Dye (Perkin-Elmer) pe un secvențiator automat ABI 3100. Amplificarea exonului 9 a dus la obținerea unui fragment de lungime variabilă, deoarece acest exon urmează o repetare în tandem a unei secvențe de 50 pb cu număr variabil de copii. În setul nostru de probe, numărul de copii a variat între patru și șapte repetări. Această repetiție interferează, de asemenea, în unele probe cu secvențierea acestui exon în direcția înainte.

Toți exonii în care au fost detectate mutații putative, au fost secvențiați în 100 de cromozomi de control fără a se găsi mutațiile.

RECUNOȘTINȚE DE REȚINUT

Mulțumim pacienților și familiilor, precum și medicilor care au furnizat materialul. Această cercetare a fost susținută de un grant (G.0404.00) din partea „Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek” (FWO) acordat lui W.V.H. Această cercetare a fost, de asemenea, susținută de granturi din partea „Société Française de Rhumatologie” (SFR), „Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris” (FERCMHP) și Shriners Hospital for Children (nr. 8540).

.