La 4 decembrie, am vizitat Clinica pentru copii speciali din inima ținutului olandez din Pennsylvania, unde un personal minuscul are grijă de peste 2000 de pacienți cu o varietate de boli ereditare. Postarea de săptămâna trecută a descris o familie în care 5 din 6 copii au o tulburare convulsivă care include trăsături autiste. Investigarea acestui sindrom în ultimii 15 ani ilustrează în mod minunat evoluția metodelor de descoperire a genelor înainte ca secvențierea să ne catapulteze într-o nouă eră tehnologică. (Atenție: urmează jargonul.)
CONEXIUNEA FENOTIPULUI CU GENOTIPUL
În prezent, pentru a identifica gena care stă la baza unei afecțiuni nediagnosticate la un copil, cercetătorii compară secvențele exomului (partea genomului care codifică proteinele) ale părinților și, eventual, ale fraților pentru a identifica variantele genetice (alelele) cauzatoare. Este rapid.
În era pre-genomică, cercetătorii au urmat o traiectorie indirectă pentru a ajunge de la fenotip la genotip:
– Constatând că simptomele „se întâlnesc în familie”.
– Descoperind că afecțiunea este mai frecventă în rândul gemenilor identici decât în rândul gemenilor fraternali și în rândul fraților pacienților decât în populația generală.
– Identificând cromozomi anormali la persoanele cu afecțiunea respectivă.
– Utilizarea studiilor de asociere la nivelul întregului genom (GWAS) pentru a identifica modelele de variație genetică (la seturi de situri cu o singură bază numite polimorfisme de un singur nucleotid, sau SNP) care ar putea semnala o variantă care cauzează boala.
– Identificarea genei și realizarea unui model de șoarece pentru a testa tratamentele.
Când Amish au părăsit Elveția la începutul anilor 1700 pentru a scăpa de persecuțiile religioase și s-au stabilit în Pennsylvania, au adus o mostră din fondul genetic european. Reproducerea între ei a amplificat mutațiile și a dus la „curse de autozigotism” în genomul lor – secțiuni de cromozomi care au aceleași secvențe de ADN pe ambele copii. Rutele de autozigotism indică faptul că două rude au moștenit seturi de variante genetice de la un strămoș comun, cum ar fi verișorii de gradul doi de la un străbunic. Aceste alele, denumite „identice prin descendență” (IDB), constituie un instrument puternic pentru descoperirea de gene dacă apar exclusiv la persoanele care au aceeași boală.
CONEXIUNEA AMISH
Băiatul pe care l-am întâlnit la clinică și 4 dintre cei 5 frați ai săi au sindromul de displazie corticală-epilepsie focală (CDFE). Acesta apare din cauza unei singure baze ADN lipsă într-o genă numită CNTNAP2.
Ca multe povești de descoperire a genelor, constatarea că mutațiile în CNTNAP2 se află în spatele unei varietăți de afecțiuni cerebrale – autism, convulsii, schizofrenie, sindromul Tourette și tulburări de limbaj – a început cu fire diferite. Să ne concentrăm asupra conexiunii cu autismul.
Chiar și cele mai vechi tehnici genetice demonstrează o componentă ereditară a autismului. Gemenii identici au o probabilitate mult mai mare de a-l avea amândoi decât gemenii fraternali; frații unui copil cu autism au un risc de 75 de ori mai mare decât cel al populației generale.
În 1998, International Molecular Genetic Study of Autism Consortium a folosit GWAS pentru a identifica 6 regiuni din genom care se potrivesc cu persoanele care au autism – principalul concurent a fost pe brațul lung al celui de-al șaptelea cromozom ca mărime, sau „7q.”
În 1999, cercetătorii au implicat CASPR2, un tip de proteină numită neurexină care, atunci când este anormală, întrerupe trimiterea unui impuls nervos. Neurexinele se aliniază cu alte proteine numite neuroligine pentru a crea sinapsele care se formează pe măsură ce un copil mic începe să exploreze lumea, consolidând memoria în învățare.
În 2003 au apărut rapoarte de rearanjare a cromozomilor care perturbă gena care codifică CASPR2, CNTNAP2, la persoanele cu sindromul Tourette și în 2007 la persoanele care au dizabilități intelectuale, întârzieri în dezvoltare, tulburări de vorbire și hiperactivitate, dar nu sindromul Tourette. Aceste afecțiuni diferite nu sunt surprinzătoare – efectele variază în funcție de locul din creier în care nivelurile de neurexină sunt dezechilibrate.
În 2006, cercetătorii de la Clinic For Special Children și de la Translational Genomics Research Institute au asociat o mutație în CNTNAP2 cu sindromul CDFE la copii Amish foarte apropiați. Convulsiile încep cam la vârsta la care tind să apară trăsăturile autiste – între 14 și 20 de luni.
Până la debutul convulsiilor, simptomele CDFE sunt subtile: întârzieri motorii minore, reflexe tendinoase profunde slabe și capete ușor mari. Copiii au dificultăți de concentrare, de imitare a persoanelor și de planificare a mișcărilor, cum ar fi târârea, croaziera și mersul. Crizele sunt frecvente și severe, iar debutul lor anunță declinul abilităților – lingvistice, cognitive și sociale. După câțiva ani, convulsiile încetează, dar intelectul rămâne stagnant în copilărie și individul necesită îngrijire pe tot parcursul vieții.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, și Holmes Morton, MD, de la Clinica și colegii lor au folosit dispozitive de microarray 100.000-SNP pentru a analiza ADN-ul a patru copii cu sindrom CDFE din trei familii Amish. Ei au găsit o regiune autozigotă cu o lungime de 7,1 milioane de baze în zona suspectă de pe 7q. (În prezent, algoritmii de astăzi depistează rapid autozigozitatea în secvențele exomei.)
Cele 7,1 milioane de baze includ 83 de gene, dar numai câteva au avut sens. Echipa a secvențiat mai întâi o genă numită CENTG3, cunoscută ca fiind cauza altor tulburări cerebrale. Dar copiii bolnavi nu aveau mutații în ea.
Apoi Dr. Puffenberger, geneticianul din echipă, a găsit o scurtătură: a observat un SNP în mijlocul CENTG3 care era heterozigotă la doi copii (două variante diferite), mai degrabă decât homozigotă (aceeași variantă în ambele copii ale cromozomului), marcând un sfârșit pentru regiunea identică prin descendență. „Un eveniment de recombinare în mijlocul genei i-a permis lui Eric să scape de o mare parte din ea pentru a găsi mutația. Este un exemplu perfect de „șansa favorizează mintea pregătită””, mi-a spus Dr. Morton. Această descoperire a redus regiunea de interes de pe 7q la 3,8 milioane de baze.
Cea de-a doua genă candidată, CNTNAP2, se întinde peste regiunea de interes. Fiecărui copil îi lipsea acolo o singură bază din ambele copii ale cromozomului 7, iar fiecare părinte avea aceeași mutație, dar într-o singură copie. Ei sunt purtători. A fost prima lege a lui Mendel la lucru.
Echipa a găsit gena lor. Apoi au căutat mai departe în comunitate, iar dintre cei 105 amish sănătoși, patru erau purtători. Nouă din 18 pacienți care aveau convulsii parțiale, dar fără un diagnostic specific, din 7 familii, aveau sindromul CDFE.
Configurările erau derutante. „O mutație poate provoca diferite tipuri de convulsii. Patru copii dintr-o familie răspund diferit. Unii sunt foarte handicapați, alții nu sunt foarte afectați”, a declarat Dr. Morton. Trei copii au fost supuși unei intervenții chirurgicale pentru a ameliora convulsiile, dar ușurarea nu a durat. Cu toate acestea, intervențiile chirurgicale au furnizat mostre de țesut cerebral care au permis cercetătorilor să descrie mai bine ceea ce nu mergea bine.
Conectivitatea în creierele predispuse la crize este un dezastru. Limitele materiei cenușii și ale materiei albe se estompează, iar unele părți ale cortexului cerebral sunt îngroșate. Neuronii înșiși nu sunt chiar în regulă. Sunt prea rotunzi, prea strânși, cu arbori dendritici deranjați. Punctele de pe neuroni indică prea mulți nuclei din glia, celulele de susținere care alcătuiesc cea mai mare parte a sistemului nervos. Raportul de cercetare din 2006 a fost poetic, descriind amigdala, sediul emoțiilor, din creierele epileptice ca fiind „insule microscopice excentrice de precursori neuronali parțial maturizați în grupuri strânse”, acoperite de glia dezlănțuită.
Portretul creierului epileptic Amish a căpătat sens în lumina lucrărilor asupra proteinei neurexină CASPR2 (care înseamnă contactin-associated protein-like 2). Neurexina formează un eșafodaj la nivelul nodurilor lui Ranvier. Nodurile sunt locurile expuse pe un axon între pernele de mielină, materialul izolator care este, de fapt, membranele celulare ale gliei înfășurate în jurul neuronului ca un bandaj în jurul unui deget. Impulsurile nervoase ocolesc nodurile, trimițând mesaje suficient de repede pentru a susține viața.
Proteinele CASPR2 la copiii Amish sunt atrofiate. Ele nu traversează membranele celulelor neuronale și nu se scufundă în citoplasmă așa cum ar trebui și, ca urmare, canalele de potasiu din apropiere se prăbușesc. Aceste canale permit în mod normal ca ionii de potasiu să se grăbească să iasă din celulele nervoase la trecerea unui impuls, resetându-le. Așadar, fără scheletul de neurexină, neuronii nu se pot reseta singuri. Transmisia se oprește. Și, cumva, încep convulsiile. Nu cred că se știe dacă convulsiile induc trăsăturile autiste sau apar direct – studiile genetice ulterioare ar trebui să indice acest lucru.
UN MODEL DE MOUSE
Daniel Geschwind, doctor în medicină și profesor de neurologie la Școala de Medicină David Geffen de la UCLA, lucra la genele autismului și a citit articolul din 2006 din New England Journal of Medicine. „M-a sunat și mi-a spus: „Mi-ați găsit gena!”. A început o colaborare frumoasă, iar el a realizat un șoarece cu mutația Amish”, a declarat Dr. Morton. Șoarecii au gena CNTNAP2 eliminată și, la fel ca oamenii, au convulsii și trăsături autiste.
„Un șoarece de obicei aleargă în jurul cuștii, în mod normal este sociabil și trăncănește. Acești șoareci nu erau nici una, nici alta”, a explicat Dr. Morton. Șoarecii au prezentat, de asemenea, comportamente repetitive și au avut convulsii.
Creierul șoarecilor mutanți a prezentat un model de conectivitate anormal care amintește de lucrările histologice anterioare. „Partea frontală a creierului vorbește mai ales cu ea însăși. Nu comunică la fel de mult cu alte părți ale creierului și îi lipsesc conexiunile de lungă distanță cu partea din spate a creierului”, a declarat Dr. Geschwind. Grupul arătase anomalii similare în creierul copiilor cu autism.
Similitudinea izbitoare dintre copiii Amish și șoareci oferă un teren de testare pentru medicamente. Risperidona, prescrisă pentru tratarea comportamentelor repetitive la copii, a avut același efect asupra șoarecilor, îmbunătățind în același timp capacitatea lor de a construi cuiburi. Dar medicamentul nu îi ajută pe copii să socializeze.
Un medicament candidat evident pentru îmbunătățirea abilităților sociale este „hormonul iubirii”, oxitocina. Acesta este abundent în aceiași neuroni din creier care sunt bogați în proteina CASPR2. Ar putea prea puțină oxitocină să provoace trăsături autiste? Rezultatele suplimentării oxitocinei sunt promițătoare, atât la șoareci, cât și la copii.
Dr. Geschwind și colaboratorii au descoperit că un spray nazal de oxitocină „îmbunătățește dramatic deficitele sociale” la șoareci. Deoarece șoarecii non-autiști nu au răspuns, hormonul pare într-adevăr să compenseze un deficit.
Fermierii amish dau deja oxitocină vacilor pentru a le contracta mușchii uterini, iar eu îmi amintesc că am primit-o pentru a revigora un travaliu în impas. Dar nu încercați acest lucru acasă. Mai multe studii clinice sunt în curs de desfășurare pentru ca oxitocina sau medicamentele care îi stimulează activitatea în creier să îmbunătățească socializarea la copiii cu autism.
Autism Speaks a finanțat primul studiu clinic cu oxitocină în 2010, iar NIH sponsorizează un studiu mai mare în curs de desfășurare cu spray nazal de oxitocină. Dar, din câte îmi dau seama, pacienții au fost înrolați pe baza diagnosticelor clinice conform DSM-IV – nu pe baza criteriului mai specific al genotipului.
Deși ideea de a încerca oxitocina pentru a îmbunătăți simptomele sociale în autism nu a necesitat cunoașterea mutației care stă la baza acesteia, astfel de informații pot adăuga precizie la orice concluzii prin luarea în considerare a mecanismului – ceea ce poate duce la dezvoltarea altor tratamente. Într-o altă postare voi analiza modul în care precizia genetică i-a permis doctorului Morton să dezvolte tratamente pentru anumite erori înnăscute ale metabolismului care sunt mult mai frecvente în rândul Amish, dar care apar totuși pe ecranele nou-născuților tuturor.
.