ARNhc – Aplicații – Ce este ARNc, cum funcționează și aplicațiile sale.

Ce este ARNhc și cum se utilizează?

Secvențele de ARN în spic de păr scurt (ARNhc) sunt, de obicei, codificate într-un vector de ADN care poate fi introdus în celule prin transfecție cu plasmidă sau prin transducție virală. moleculele de ARNhc pot fi împărțite în două categorii principale pe baza modelelor lor: ARNhc simplu cu buclă de tulpină și ARNhc adaptat la microARN. Un ARNhc simplu cu buclă de tulpină este adesea transcris sub controlul unui promotor al ARN Polimerazei III (Pol III) . Transcriptul de 50-70 de nucleotide formează o structură în buclă de tulpină constând dintr-o regiune de 19 până la 29 de pb de ARN bicatenar (tulpina) acoperită de o regiune de ARN preponderent monocatenar (bucla) și de o supraînălțare 3′ dinucleotidă . ARNhc simplu cu buclă de tulpină este transcris în nucleu și intră în calea ARNi similar cu un pre-microARN. ARNhc mai lung (> 250 nucleotide) adaptat la microARN este un model care se aseamănă mai mult cu moleculele de pre-microARN nativ și constă într-o structură de tulpină de ARNc care poate include nepotriviri asemănătoare microARNcului, unită de o buclă și flancată de secvențe de microARN endogene 5′ și 3′ . ARNhc adaptat la microARN, la fel ca și pinul de păr simplu cu buclă de tulpină, este, de asemenea, transcris în nucleu, dar se crede că intră mai devreme în calea RNAi, similar unui pri-microARN endogen.

Tehnologiile ARNc sunt bazate pe ADN, ceea ce oferă flexibilitate în proiectarea vectorului. Cele mai multe sisteme shRNA bazate pe vectori conțin un marker selectabil pentru a permite eliminarea celulelor care nu au fost transfectate sau transducute cu succes și menținerea celulelor cu knockdown genetic susținut. Casetele de exprimare a ARNhc pot fi, de asemenea, încorporate în sisteme de vectori virali, inclusiv retrovirusuri, virusuri adeno-asociate, adenovirusuri și lentivirusuri, care permit integrarea stabilă în genomul gazdei și exprimarea din acesta. Aceste strategii virale permit transmiterea ARNhc la liniile celulare care sunt refractare la transfecție. Se pot include, de asemenea, markeri fluorescenți (cum ar fi o proteină fluorescentă verde sau roșie) pentru urmărirea celulelor care exprimă ARNhc. Performanța ARNhc este influențată de mulți factori, inclusiv de eficiența transducției sau a transfecției, de promotorul care conduce expresia ARNhc și de modificările epigenetice (care pot duce la reducerea la tăcere a expresiei ARNhc). Mai mult, influența pe care fiecare dintre acești factori o are asupra performanței vectorului poate diferi în funcție de linia celulară sau de tipul de celule . Opțiunile SMARTchoice pentru promotori și reporteri sunt disponibile pentru a ajuta cercetătorii să selecteze promotorii optimi pentru expresia ARNhc și reducerea la tăcere a genelor. În cele din urmă, atunci când aceste casete de exprimare a ARNhc sunt cuplate cu promotori inductibili, ca în cazul SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA sau al sistemului de vectori TRIPZ, cercetătorii pot proiecta studii pentru a modula temporal și spațial expresia genelor .

Animare video: Interferența ARN

Cum este livrat ARNhc într-o celulă?

Există două opțiuni pentru livrarea ARNhc pe bază de ADN în celule. Pentru plasmide, se pot folosi metode tipice de transfecție, cum ar fi utilizarea de reactivi de transfecție lipidică sau electroporarea. Particulele lentivirale sunt o alegere excelentă pentru celulele greu de transfectat și în situațiile în care este necesară o eficiență ridicată sau în care trebuie livrate mai multe construcții pe celulă. Cei mai mulți vectori moderni au markeri selectibili care permit uciderea selectivă a celulelor din cultură care nu au fost transfectate sau transducute cu succes, astfel încât să se poată dezvolta o cultură pură.

Ce afectează funcția și specificitatea ARNhc?

Dezactivarea optimă a genelor este o cerință pentru o ARNi reușită cu ajutorul sistemelor ARNhc. Proiectarea rațională a secvențelor de ARNhc s-a bazat în mare parte pe algoritmi dezvoltați cu ARNi. În timp ce unele reguli de proiectare a siARN se aplică la ARNhc, algoritmi mai rafinați de proiectare a ARNhc vor îmbunătăți probabil în viitor reducerea la tăcere a genelor țintă pentru ARNhc . Pentru a prezice secvențe funcționale de ARNhc, algoritmul SMARTvector™ shRNA de la Dharmacon selectează secvențele țintă pe baza a numeroase criterii, inclusiv preferințele nucleotidelor dependente de poziție, structura secundară și profilurile de stabilitate termodinamică specifice scheletului SMARTvector pe bază de microARNm. În plus, algoritmul SMARTvector include mai multe criterii pentru creșterea specificității.

Ca și în cazul siARN-urilor, abordările bioinformatice pot fi aplicate pentru a crea ARNhc specifice țintelor, minimizând în același timp potențialul de efecte în afara țintei. Se știe că concentrațiile ridicate de intermediari de silențiere contribuie la evenimente în afara țintei, dar nivelul intermediarilor este dificil de controlat atunci când ARNhc sunt exprimate exogen. Mai multe publicații au documentat dovezi că, în condiții specifice, nivelurile ridicate de expresie a ARNhc simplu cu buclă de tulpină pot satura calea endogenă de ARNi și pot duce la apariția unor fenotipuri neintenționate . Alte studii au sugerat că utilizarea unui ARNhc adaptat la microARN poate reduce toxicitatea celulară pentru experimentele de ARNi in vivo, datorită faptului că aceste schelete sunt procesate mai eficient atât de Drosha-DGCR8, cât și de Dicer .

aplicațiile ARNhc

ARNhc oferă posibilitatea unei silențieri genetice prelungite. Transducția ARNsh pe bază de viruși permite accesul la celule, cum ar fi celulele primare și neuronale, care sunt dificil de transfectat prin strategii tradiționale pe bază de lipide cationice. ARNhc pe bază virală au fost, de asemenea, utilizate pentru a evalua funcția genelor la scara întregului genom, utilizând grupuri de construcții de silențiere. În prezent, ecranele de tip pool sau array sunt utilizate pe scară largă pentru a efectua ecrane de mare randament pentru a identifica genele necesare într-o varietate de procese, cum ar fi supraviețuirea și proliferarea celulelor canceroase, componente ale căilor de suprimare a tumorilor, modulatori ai ceasului circadian al mamiferelor, supresori ai tranziției mezenchimale epiteliale, mediatori gazdă ai replicării HIV-1 și regulatori ai migrației celulare. Puterea screening-ului RNAi grupat a fost, de asemenea, extinsă la screening-ul funcției genelor în modele animale pentru a investiga biologia in vivo .

Ce instrument de ARNm este potrivit pentru nevoile dumneavoastră?

Ghid de selecție a ARNm

Oferim o selecție de reactivi și biblioteci de ARNm. Acest ghid de selecție rapidă vă va ajuta să determinați cea mai bună opțiune pentru nevoile dvs. specifice.

Produse recomandate

shRNA – Produse

• Reactivi pe bază de vectori lentivirali pentru interferența ARN.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Faceți alegeri inteligente, în cunoștință de cauză, pentru o silențiere genetică de succes în celulele dvs. de interes.

SMARTvector Inducible shRNA

• Cel mai avansat și mai flexibil shRNA unic vectorial inductibil disponibil pentru o silențiere genetică strict controlată.

Pooled Lentiviral Screening Libraries

• Construcția optimizată de pool-uri de înaltă calitate, instrumente de analiză complete și protocoale validate sunt esențiale pentru un rezultat de succes atunci când se face screening-ul cu biblioteci lentivirale grupate.

Resurse recomandate

shRNA – Resources

• Găsește ghiduri de produs, întrebări frecvente și multe altele.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Nota tehnică care descrie fluxul de lucru experimental SMARTchoice shRNA în celule în suspensie.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Manual tehnic

• Platforma este un sistem inovator, ideal pentru studii mediate de ARNi.

GIPZ Lentiviral shRNA – Manual tehnic

• Protocoale experimentale pentru knockdown de gene folosind GIPZ lentiviral shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroARNs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) Biogeneza microARN-urilor: tăiere și tăiere coordonată. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Suprimarea stabilă a expresiei genelor prin ARNi în celule de mamifere. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Expresia eficientă a ARN-ului mic de interferență în celulele umane. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Biblioteci shRNA de a doua generație care acoperă genomurile umane și de șoarece. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Analiza funcțională a diverșilor promotori în vectorii lentivirali în diferite stadii de diferențiere in vitro a celulelor stem embrionare de șoarece. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Vectori lentivirali pentru exprimarea îmbunătățită a genelor în celulele hematopoietice umane. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-like family of transcription factor 9, un factor de transcripție asociat diferențierii, suprimă semnalizarea Notch2 și inhibă celulele stem care inițiază glioblastomul. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji coordonează controlul activității enzimatice PRC2 și a ocupării genelor țintă în celulele pluripotente. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Complexul citoplasmatic FANCA-FANCC interacționează și stabilizează proteina nucleofosmină leucemică (NPMc) dislocată în citoplasmă. Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatalitate la șoareci datorată suprasaturării căilor microARN/ARN cu fir de păr scurt celulare. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) MiARN-urile artificiale atenuează toxicitatea mediată de ARNhc în creier: implicații pentru dezvoltarea terapeutică a ARNi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) RISC uman cuplează biogeneza microARN-urilor și silențierea post-transcripțională a genelor. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Highly parallel identification of essential genes in cancer cells. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Descoperirea genelor de proliferare a cancerului prin genomică funcțională. Science 319(5863): 620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 este un regulator negativ al tranziției epiteliale-mesenchimale și al metastazelor în cancerul de sân. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Noi ținte de knockdown HIV-1 identificate de o bibliotecă de ARN shRNA îmbogățită de kinaze/fosfataze folosind un ecran iterativ pe termen lung în celulele T Jurkat. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) A genome-wide short hairpin RNA screening of jurkat T-cells for human proteins contributing to productive HIV-1 replication. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Inhibarea terapeutică a miR-208a îmbunătățește funcția cardiacă și supraviețuirea în timpul insuficienței cardiace. Circulation 124(14):1537-1547.