Trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs) são os blocos de construção essenciais das moléculas de ácido nucleico, e como tal são componentes necessários das misturas de PCR, uma vez que não poderia ser gerado ADN novo (amplificado) sem eles. Os quatro desoxinucleotídeos individuais que compõem uma sequência de ADN (ou seja deoxiadenosina trifosfato, dATP; deoxitymidina trifosfato, dTTP; deoxicitosina trifosfato, dCTP; e trifosfato de desoxiganosina, dGTP) são normalmente adicionados às misturas de PCR e RT-PCR em quantidades equimolares, embora se a sequência de ADN alvo a ser amplificada pela PCR compreender principalmente dATP/dTTP (razão AT) ou principalmente dGTP/dCTP (razão GC), então a razão molar dos dNTPs adicionados à mistura de PCR pode ser alterada de modo a ter em conta este desequilíbrio. Os dNTPs são normalmente adquiridos individualmente ou como uma mistura (equimolar) de fornecedores comerciais (por exemplo, Roche, Promega, etc.), e são quimicamente estáveis quando armazenados em soluções aquosas ligeiramente alcalinas a -20°C. Entretanto, deve-se notar que os dNTPs são naturalmente ácidos em solução; portanto, soluções de trabalho e de estoque podem ter que ser neutralizadas com compostos alcalinos antes do armazenamento a longo prazo. As soluções dNTP neutralizadas são normalmente ajustadas a 10 mM de soluções de reserva por espectrofotometria, ou pela adição do volume correto de água estéril ao produto liofilizado diretamente após sua síntese química. Algumas PCRs podem beneficiar do uso de dNTPs “PCR-grade” altamente purificados (Roche) que contêm menos de 0,9% de difosfatos de desoxinucleótidos (dNDP), são >99% puros, e livres de contaminantes tais como nucleótidos modificados e tetrapirofosfato. Estes dNTPs (mais caros) de alta pureza podem ser úteis para amplificar com sucesso o ADN PCR a partir de preparações que contenham um número muito baixo de cópias do ADN alvo.
Em algumas aplicações e protocolos de PCR, um dos quatro dNTPs pode ser substituído por um dNTP análogo, por exemplo inosina,7-deaza-2′ -deoxiganosina, ou um dNTP modificado, por exemplo um dNTP com rótulo de biotina, fluorophora ou radioactivamente. Tais modificações permitem que aplicações posteriores de processamento pós-PCR sejam realizadas.