Click chemistry interface sites
Supomos que áreas da superfície de uma proteína que são compatíveis em termos de associação são mais prováveis de gerar uma estrutura integrada através da formação de interações não covalentes mutuamente compatíveis. Como as proteínas são monoméricas, essas interações são, na melhor das hipóteses, fracas e transitórias, portanto não persistirão, argumentamos que precisávamos de um “parafuso” molecular como parte do sítio de interface para promover e estabilizar quaisquer novas interações. O primeiro passo é identificar regiões sobre as proteínas alvo que têm o potencial inerente de interagir. ClusPro 2.040 (cluspro.org) foi usado para gerar configurações de dimer em potencial. Os modelos de homodímeros sfGFP de saída foram refinados, analisados e classificados usando RosettaDock41,42 (Tabela Complementar 1). A configuração mais elevada é mostrada na Fig. 1b (que é o modelo mais próximo da estrutura determinada abaixo; vide infra), com as próximas 4 configurações classificadas mostradas na Fig. 1 do Suplemento. Enquanto foram observadas diferentes orientações de um sfGFP para o outro, foram encontrados rotineiramente resíduos revelados 145-148, 202-207 e 221-224 que contribuem para a interface com o dimer. Para aparafusar as duas proteínas juntas, foi utilizada a química de codificação bioorthgonal de Click (Fig. 1a). O benefício comparado, por exemplo, com as ligações de dissulfeto inclui cadeias laterais mais longas para superar potenciais choques estéreis, melhor estabilidade de crosslink e a capacidade de gerar resíduos de ligação não simétricos (diferentes resíduos de ligação em diferentes monômeros) e heterodímeros de uma maneira projetada 1 para 1 (vide infra).
Baseado nos modelos com dímeros, três resíduos foram selecionados para substituição com os dois ncAAs compatíveis com Click, SCO43 (alkyne tenso) e azF (azida)44,45 (Fig. 1a). H148 e Q204 foram escolhidos com base na sua localização na interface do dímero putativo (Fig. 1b e Suplementar Fig. 1). Ambos os resíduos são conhecidos por serem facilmente modificados com pequenas moléculas de adutos de ciclooctyne na incorporação de azF34,46, e se encontram perto do centro funcional, o cromóforo sfGFP (CRO) (Fig. 1b). A análise do deslocamento de mobilidade do gel revelou que a dimerização foi bem sucedida (Fig. 1c, d); isto foi confirmado pela análise de espectrometria de massa (Suplementar Fig. 2). O resíduo 132 não foi previsto na interface do dímero (Fig. 1b e Suplemento 1), mas é conhecido por ser compatível com uma gama de adutos alquídicos tensos que variam de corantes46 a nanotubos de carbono35 a DNA isolado36. Assim, ele atua como um bom teste de nossa capacidade de prever interfaces proteína-proteína e compatibilidade de reação Click. Apesar do resíduo 132 estar exposto à superfície, nenhum produto com dímeros foi observado usando sfGFP132azF com proteína contendo SCO (Suplemento Fig. 3) indicando a importância da compatibilidade da interface superficial e a utilidade da análise em silico para ajudar a identificar locais compatíveis com a química do click. Tanto choques estéreis e/ou interações proteína-proteína que persistem por mais tempo em outras regiões podem dificultar o crosslinking covalente no resíduo 132,
Positive functional switching on forming sfGFP148x2 dimer
H148 forma uma ligação H com CRO (Fig. 3). 1b) e desempenha um papel importante no fechamento de prótons que regula a população do neutro A (λmax ~ 400 nm, CRO A) e a forma aniônica B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 presente no estado de solo. A forma B predomina na sfGFP mas ao incorporar azF no lugar de H148 (sfGFP148azF) a remoção da ligação H resulta no estado A agora predominante33,34 (Fig. 2a e Tabela 1). A incorporação de SCO no resíduo 148 (sfGFP148SCO) provoca um efeito semelhante, com predominância de CRO A mas com um deslocamento vermelho menor (λmax 492 nm) na forma de CRO B menor (Fig. 2a e Tabela 1).
> Propriedades espectrais das variantes sfGFP148 antes e após a dimerização. a Absorbância e emissão de b fluorescência (na excitação a 492 nm) de sfGFP148x2 (vermelho), sfGFP148SCO (tracejado preto) e sfGFP148azF (preto). A emissão de fluorescência foi normalizada para sfGFPWT. São indicados picos de absorção devido ao estado neutro CRO A e estado CRO B de fenolato. c Comparação dos espectros de absorção sfGFPWT (verde) com sfGFP148x2 (vermelho). A linha tracejada verde representa o valor esperado se ε em λmax for simplesmente dobrado para sfGFPWT. d Histograma de intensidade de fluorescência de uma molécula para sfGFP148x2 dímeros (115 trajectórias compostas de 1742 manchas), com dois traços representativos do curso de fluorescência de cada dímero (ambos com dados filtrados crus e Cheung-Kennedy). O histograma das intensidades de fluorescência sfGFP148x2x2 observadas é descrito por uma distribuição log-normal mista de dois componentes. Traços representativos de cursos de tempo fluorescentes ilustram o comportamento fluorescente tipicamente observado do dímero. Com fluorescência prolongada observada a ~80-100 contagens correspondentes ao primeiro componente do histograma. Alguns dímeros exibem rápidas e breves incursões a estados de maior intensidade, dando origem ao segundo pico de intensidade mais alto no histograma. Traços adicionais podem ser encontrados na Figura Complementar 5
Dimerização de sfGFP148azF e sfGFP148SCO produz dois efeitos positivos significativos: (i) liga a fluorescência a ~490 nm devido à promoção da forma CRO B; (ii) aumenta muito o brilho através do aumento do coeficiente de absorvância molar a 490 nm (Fig. 2a e Tabela 1). O maior pico de excitação é alterado para vermelho na dimerização (λmax 492 nm) em comparação com sfGFPWT (λmax 485 nm) (Tabela Suplementar 3). A razão de absorvância de 490:400 nm muda por uma ordem de grandeza de ~0,5 para os monómeros para ~5 para o dímero, com a forma CRO B dominando o espectro de absorvância do dímero (Fig. 2a) apesar da aparente ausência de uma espécie que possa substituir o papel do grupo imidazol H148. Exemplos anteriores de modificação do sfGFP148azF com pequenos adutos de moléculas ou foto-ativação resultam na melhor das hipóteses em conversão parcial para a forma CRO B33,34. O interruptor de absorção de 10 vezes é espelhado na emissão de fluorescência; a excitação a 490 nm resulta numa emissão ~20 vezes maior do que qualquer um dos monómeros (Fig. 2a). Além disso, o dímero mostra uma função melhorada mesmo quando comparado com o sfGFPWT original da superpasta (Fig. 2b e Tabela 1). A absorção e brilho molar aumentou ~320% para sfGFP148x2 (~160% por CRO) (Fig. 2b) maior do que o esperado para um simples aumento aditivo se as unidades monoméricas estiverem agindo independentemente umas das outras.
Para investigar a importância da ligação biorthogonal, construímos uma ligação clássica baseada em dissulfito através da mutação de H148 para cisteína. As variantes sfGFPH148C foram dimerizadas, mas apenas na presença de Cu2+ (Suplemento Fig. 4). As propriedades espectrais sugeriram que o dímero era menos fluorescente em comparação com sfGFP148x2 e sfGFPWT (Suplemento Fig. 4). O monômero sfGFPH148C mostrou a mudança esperada de CRO B para CRO A. Enquanto uma mudança de CRO A para CRO B foi observada na dimerização da sfGFPH148C, o dímero teve uma absorção por molar CRO menor que a sfGFPWT e significativamente menor que a sfGFP148x2; uma população significativa do estado A ainda foi observada. A emissão de fluorescência na excitação a 490 nm para o dimer sfGFPH148C foi cerca da metade da do sfGFPWT. Assim, a abordagem biorthogonal gerou uma espécie dimérica com melhor desempenho do que a ligação clássica de ligação de dissulfureto.
Base molecular para comutação funcional em sfGFP148x2
A estrutura cristalina de sfGFP148x2 (ver Tabela Complementar 2 para estatísticas) revela que os monómeros formam uma extensa interface dimérica com interacções de longo alcance ligando os dois centros CRO. As unidades monoméricas de sfGFP148x2 são dispostas em uma disposição quase simétrica de cabeça para cauda compensada por ~45° em relação umas às outras (Fig. 3a). A disposição do monômero antiparalelo lado a lado é a mais próxima da do modelo mais graduado (Fig. 1 Suplementar e Tabela Suplementar 1). A densidade de elétrons do novo triazol é claramente definida (Fig. 3b) e forma a ligação alongada anti-1,4-triazol que está parcialmente enterrada e intimamente associada a ambas as unidades monoméricas formando assim uma parte integrante da interface dimer (Fig. 3c). As CROs estão separadas 15 Å apontando uma para a outra (Fig. 3a).
Estrutura da sfGFP148x2. A proteína contendo azF é colorida de verde e a proteína contendo SCO é colorida de cian. um Arranjo geral de monômeros, incluindo um esboço esquemático da relação dos dois monômeros. CROs são mostrados como esferas e os resíduos 148 como varas. b O mapa de densidade de elétrons (2Fo-Fc, 1.0 sigma) para a ligação cruzada é mostrado confirmando a formação do anti-regioisômero. c A embalagem hidrofóbica ao redor da interface do dímero com a ligação cruzada SPAAC é mostrada como esferas transparentes. d A rede de H-bond contribui para a interface do dímero. Código de submissão PDB 5nhn
A interface tem características similares aos dímeros naturais48. A área enterrada da interface é de ~1300 Å2, com geralmente os mesmos resíduos de cada monômero contribuindo (Fig. 3c, d). A ligação H desempenha um papel importante com os resíduos E142, N146, S147, N149 e N170 de ambos os monómeros que contribuem para oito ligações H inter-subunidades (Fig. 3b). A estrutura mostra que as interfaces de dímeros naturais podem ser imitadas e estabilizadas através do uso de monômeros Click-linked, que a modelagem original sugeriu serem viáveis, mas onde provavelmente muito fracos ou transitórios para persistir sem a ligação embutida. Assim, pode ser que nossa abordagem possa ser usada para estabilizar interações proteína-proteína fracas mais amplamente transitórias, formando assim interfaces definidas.
Dimerização induz uma série de mudanças conformacionais para formar uma rede de interação de longo alcance que está subjacente ao mecanismo pelo qual o sfGFP é ligado e a luminosidade melhorada. A estrutura sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 mostra que 148azF ocupa uma posição similar a H148 no sfGFPWT, mas não pode, da ligação H crítica ao grupo CRO fenol OH que promove a formação do estado CRO B. Na dimerização, a modificação de 148azF através da formação do elo triazol com 148SCO no monômero cognato resulta em uma mudança tanto em sua espinha dorsal quanto na posição da cadeia lateral causando um buraco que agora pode ser ocupado por uma molécula de água no dímero (W1azF na Fig. 4a). A água pode se ligar H a CROazF e a espinha dorsal carbonila de 148azF (Fig. 4). Uma água equivalente está presente na unidade monomérica sfGFP148SCO, (W1SCO), que forma interações similares. Estas moléculas de água estruturadas têm o potencial de substituir a interação H-bond perdida na remoção de H148, ativando assim o dímero através da promoção da formação de CRO B no estado do solo. As moléculas de água também são enterradas na interface do dímero, de modo que a troca dinâmica com o solvente a granel será muito reduzida. Além disso, os dois CROs estão agora ligados por uma extensa rede predominantemente de água que atravessa a interface do dímero (Fig. 4b, c). A análise da composição do túnel revelou que três moléculas de água em cada unidade (W1azF/SCO, W2azF/SCO e W3azF/SCO) são simétricas; W4 combinado com a espinha dorsal do F145SCO fornecem a ponte através da interface do dímero para ligar as duas redes de água juntas. Desta forma, a dimerização gera uma rede de H-bond alargada e inter-monómero rica em água, promovendo assim uma mudança da CRO de estado A para a forma B.
>Ativação através de mudanças conformacionais e redes de comunicação inter-subunidades na formação de sfGFP148x2. A proteína portadora de azF é de cor verde e a proteína portadora de SCO é de cor cian. uma Alteração conformacional para azF148 na dimerização. A sfGFP148azF (PDB 5bt034) é colorida em magenta. b Análise CAVER69 de um canal proposto ligando os dois CRO da sfGFP148x2. c Água dominada de longo alcance H-rede de ligação entre a CRO dos monómeros azF (CROazF) e SCO (CROSCO)
Análise de fluorescência de molécula única da sfGFP148x2
Microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) foi utilizada para investigar o comportamento fluorescente dos dímeros sfGFP148x2 ao nível da molécula única. O curso temporal de intensidade de fluorescência dos dímeros sfGFP148x2 individuais demonstrou uma gama de estados de intensidade, com predominância da fluorescência em ~80-100 contagens e mostrando maior longevidade do que a subpopulação de estados de intensidade mais elevada, com estas caracterizadas por breves incursões a uma gama de intensidades de ~100 a 300 contagens (Fig. 2c). Os traços de fluorescência também demonstram fotoestabilidade prolongada com longos períodos de fotobleaching (Fig. 2c e Suplemento Fig. 5). Em comparação, sfGFPWT fotobleaches mais rapidamente, com traços fluorescentes mostrando um único estado de intensidade em que os estados geralmente duram por períodos mais curtos (Suplemento Fig. 6). Além disso, o sfGFPWT monomérico foi às vezes encontrado em um estado inicial escuro, não fluorescente, antes do início da fluorescência e subsequente fotoblematização (Suplemento Fig. 6). A extração da média da fluorescência consecutiva ‘no tempo’ antes do fotobleaching e ocupação de estados transientes não fluorescentes (piscando), descobriu que sfGFP148x2 exibe períodos mais longos de fluorescência contínua (média 0,9 s), em comparação com sfGFPWT (0,65 s). Dada a semelhança na intensidade de fluorescência medida de uma única molécula, o aumento dos tempos de ON e o tempo de vida útil de fotobleaching provavelmente contribuem para o aumento da fluorescência observada em medições de conjuntos em estado estacionário de sfGFP148x2 (Fig. 2a).
Numa tentativa de racionalizar a gama de estados de fluorescência observados nos traços de dimerização, foi gerado um histograma de todas as intensidades medidas (Fig. 2c). Ao contrário do sfGFPWT (Figura Complementar 6) que mostra uma distribuição log-normal única49 , o sfGFP148x2 favoreceu um ajuste de dois componentes50 (Fig. 2c). A distribuição de intensidade medida mostra um pico de intensidade predominantemente inferior (~90 contagens) e um pico de intensidade parcialmente superior sobreposto, como consequência das breves incursões a estados de intensidade mais elevada observadas nos traços de fluorescência de molécula única. Enquanto uma distribuição bimodal de intensidade pode ser normalmente esperada em um dímero composto por dois fluoróforos co-localizados ativos independentemente, com cada fluoróforo seqüencialmente foto-recuperável, os traços de intensidade de uma molécula não são consistentes com este modelo e mostram uma falta de dois estados bem definidos. O simples comportamento de estado on/off do sfGFPWT é raramente observado nos vestígios de dímeros que não se apresentam como o adutor antecipado de dois vestígios monoméricos, mostrando, ao invés disso, um comportamento mais complexo.
Função aumentada na formação sfGFP204x2 dimer
Para explorar como diferentes sites de ligação podem eliciar efeitos funcionais, investigamos a alternativa dimer sfGFP204x2 (Fig. 5a) construída acima (Fig. 1d). Encontramos que a dimerização melhorou as propriedades espectrais acima da simples adição das proteínas monoméricas ou sfGFPWT, destacando novamente os benefícios sinérgicos da dimerização. A incorporação de azF ou SCO no resíduo 204 teve pouco efeito sobre as propriedades espectrais em comparação com sfGFPWT 46 (Fig. 5b e Tabela 1). A forma B CRO predominou nas formas monoméricas; tanto a absorção molar como as intensidades de emissão onde são semelhantes entre si e sfGFPWT. A emissão de fluorescência do sfGFP204SCO foi ligeiramente reduzida (80% do sfGFPWT; Tabela 1). Ao formar o dimer sfGFP204x2 (ver Fig. 1d e Suplemento Fig. 2 para evidências) a análise espectral mostrou melhora funcional em termos dos parâmetros espectrais centrais: coeficiente de absorvância molar (ε) e emissão de fluorescência (Fig. 5b e Tabela 1). Na dimerização, ε aumentou até 400% comparado com os monômeros iniciais para 160.000 M-1 cm-1. Isto equivale a uma média por absorção molar CRO de 80.000 M-1 cm-1, quase duplicando o brilho em comparação com os monômeros iniciais, e 31.000 M-1 cm-1 maior em comparação com o sfGFPWT. Em linha com o aumento da capacidade de absorção de luz, a emissão de fluorescência também foi aumentada; a emissão normalizada por CRO foi 180% maior do que a do monômero sfGFP204azF. Usando o cálculo Strickler-Berg51 (website huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) a vida útil da fluorescência cai de 3,2 ns para sfGFPWT para 0,92 ns para sfGFP204x2. Assim, como com sfGFP148x2 a estrutura dimérica de sfGFP204x2 tem uma probabilidade aumentada de excitação eletrônica e saída de fluorescência comparada com as formas monoméricas (veja a Fig. 8 suplementar para comparação espectral de dímeros). Isto é tanto mais impressionante para ambas as formas diméricas quanto sfGFPWT é uma referência para o desempenho da proteína fluorescente verde.
Propriedades espectrais das variantes sfGFP204 antes e depois da dimerização. um esquema de dimerização de sfGFP204azF e sfGFP204SCO para formar sfGFP204x2, b Absorvância e fluorescência c (na excitação a 487 nm) de sfGFP204x2 (azul), sfGFP204SCO (tracejado preto), sfGFP204azF (preto) e sfGFPWT (verde). A emissão de fluorescência foi normalizada para GFP. A linha tracejada vermelha representa o valor de absorção molar para uma simples adição de dois sfGFPWT individuais em λmax
A importância da simetria para a sinergia
Os homodímeros de proteínas naturais são geralmente simétricos1,52 e tal simetria foi imitada em nosso dímero artificial através de um resíduo comum de reticulação. Nós investigamos a importância de um resíduo comum de reticulação (como uma mímica da simetria estrutural) para a sinergia funcional. A vantagem da química biorthogonal é que os cabos de reação mutuamente compatíveis permitem a construção de pares definidos (ou seja, 148 + 204 = 148-204 e não 148-148 ou 204-204), evitando assim a formação de produtos indesejáveis que serão difíceis de separar.
Dimers foram gerados que ligaram os resíduos 148 e 204 nas duas combinações disponíveis (148SCO+204azF e 148azF+204SOC). A fluorescência de estado estável revelou que em ambas as formas diméricas, as formas protonadas e desprotonadas de CRO estavam claramente presentes (Fig. 6a, b). O dímero 148azF-204SCO ligado ao sfGFP204SCO exibiu uma mudança nas populações relativas das formas A e B, com um aumento significativo no coeficiente de absorvância molar a 490 nm (Fig. 6a); foi quase o dobro do sfGFP204SCO original e ~30% maior do que o previsto pela simples adição dos espectros do monômero. A altura relativa do pico de 400 nm permanece similar tanto no sfGFP148azF quanto no dímero 148azF-204SCO ligado, sugerindo que a população da forma desprotonada é similar no dímero ao monômero original. A dimerização através da combinação 148SCO-204azF alterou as populações relativas das formas protonada e desprotonada, mas a redução no pico de absorção de 400 nm não foi acompanhada por um aumento concomitante no pico de 490 nm (Fig. 6b). De facto, a dimerização foi largamente prejudicial, uma vez que ambos os picos de absorvância principais tinham um coeficiente de absorvância molar inferior ao simples espectros de adição dos monómeros (Fig. 6b). É claro que os dímeros assimetricamente ligados são menos fluorescentes e contêm uma população mista significativa dos dois estados CRO em comparação com os dímeros simetricamente ligados, portanto, neste caso, a simetria tem importantes implicações funcionais.
>Dímeros não simétricos sfGFP148azF-204SCO e sfGFP148SCO-204azF. a Absorbance spectra of sfGFP148azF-204SCO (linha vermelha) comparado com sfGFP148azF (linha preta) e sfGFP204SCO (linha azul). b Espectros de absorção de sfGFP148SCO-204azF (linha vermelha) em comparação com sfGFP148SCO (linha preta) e sfGFP204azF (linha azul). c Modelo da consequência estrutural da ligação de diferentes resíduos para gerar um dímero sfGFP não ligado simetricamente
Heterodímetros e integração funcional
Heterodímetros, no qual um dímero é composto por duas proteínas diferentes, é um estado alternativo de dimerização comumente observado1,2. Também nos permite projetar novos complexos nos quais proteínas funcionalmente distintas podem ser ligadas. A vantagem do acoplamento bioorthogonal é a capacidade de gerar dímeros (hetero)de uma única espécie definida, composta por duas unidades proteicas diferentes (ou seja, A + B = A-B e não A-A, B-B, mistura A-B que pode ser difícil de separar). A proteína fluorescente amarela Vênus29 foi escolhida como a proteína parceira da sfGFP, dada a sobreposição espectral entre as duas (Suplemento Fig. 9). As diferenças de sequência são mostradas no Suplemento Fig. 10.
SfGFP148SCO foi combinada com o equivalente azF contendo Vénus (Venus148azF) para gerar o GFVen148 (ver Suplemento Fig. 11 para evidências). Novas características espectrais emergem sugerindo que um sistema integrado foi gerado. A formação do GFVen148 gera um dímero que mostra um melhor brilho em comparação com o sfGFP148SCO ou Venus148azF (Fig. 7a e Tabela Suplementar 3). Curiosamente, o dímero tem propriedades espectrais intermediárias de monômeros individuais sem qualquer alargamento significativo do pico (Fig. 7a, b e Suplemento Fig. 12a) sugerindo que os dois centros CRO se tornaram funcionalmente integrados em termos de emissão de fluorescência. O principal λmax é 505 nm, intermediário entre sfGFP (492 nm) e Vênus (517 nm). O ε equivalente à forma B CRO (490-510 nm região) aumenta significativamente (~4-5 vezes), maior do que os espectros simples aditivos dos monómeros, enquanto que a população A CRO diminui mas ainda é observada (Fig. 7a). Isto é igualado por um aumento de ~4 vezes na intensidade de emissão na excitação a 505 nm (Fig. 7b). Observa-se um único pico de emissão que também é intermediário entre os dois monômeros, independentemente do comprimento de onda de excitação (λEM a 517 nm; Fig. 7b, c); observou-se um único pico de emissão em vez de um duplo ou ampliado na excitação a 490 nm (capaz de excitar ambos os CROs) sugerindo que uma única espécie está emitindo. Um espectro aditivo de espectros de monômeros individuais que simula duas proteínas de ação independente apóia a idéia de uma nova função integrada por ser mais ampla e red-deslocada em comparação com o perfil de emissão medida GFVen148x2 (Suplemento Fig. 12b). A emissão na excitação a 400 nm também foi medida, pois a Vênus148azF tem pouca absorvância nesse comprimento de onda em comparação com o GFVen148. A intensidade de emissão foi 30 vezes maior para GFVen148 comparado com Vênus148azF monomérico com pico de emissão a 517 nm (Fig. 7c e Suplemento Fig. 12c). Ao invés de exibir o FRET clássico, como seria de se esperar (vide supra), o GFVen148 parece atuar como uma única entidade em termos de saída de fluorescência. Isto poderia sugerir que dois CROs estão agora a agir predominantemente como uma espécie com os aspectos estruturais observados para o sfGFP148x2 (como a rede de água) a desempenhar um papel. A presença de um estado A neutro significativo da CRO sugere que as duas unidades monoméricas não estão totalmente sincronizadas. Isto não nega, no entanto, o claro impacto que a dimerização pode ter na geração de novas propriedades espectrais como as observadas no GFVen148.
>Comunicação entre heterodímeros. a Absorbance spectra of GFVen148. As linhas tracejadas vermelha, dourada, verde e preta representam o GFVen148, Venus148azF, sfGFP148SCO e o espectro de adição de monômeros, respectivamente. b Intensidade de emissão de 0,5 μM GFVen148 (vermelho) e Venus148azF (ouro) sobre excitação a 505 nm. c Emissão normalizada de GFVen148 (vermelho) e Venus148azF (ouro) sobre excitação a 400 nm. d Disposição espacial de GFP e Venus CRO baseada na estrutura GFP148x2. e Espectros de absorção de GFVen204. Os espectros de emissão para GFVen204 (azul) e Venus204azF (dourado) representam o espectro de adição de monômeros, respectivamente. f Espectros de emissão para GFVen204 (azul) e Venus204azF (dourado). As linhas não quebradas, tracejadas e pontilhadas representam excitação a 510 nm e 450 nm, respectivamente. Inset é espectros de emissão sobre excitação a 400 nm. g Disposição espacial de sfGFP e Venus CRO baseada na estrutura sfGFP204x2 (PDB 5ni3)
As com sfGFP, incorporação de azF no lugar de Q204 (denominado Venus204azF) teve pouco efeito sobre as propriedades espectrais de Vênus (Tabela Suplementar 3). A ligação covalente via 204 SPAAC (fazendo o GFVen204) gerou com sucesso um dimer (Suplemento Fig. 11). O GFVen204 combinou as características espectrais de ambos os monômeros gerando uma espécie com λMax a 490 e 514 nm (razão de 1:1.2) (Fig. 7e, f e Tabela Suplementar 3). Venus204 também absorve a 490 nm mas na razão de 1:2.7 a 514 nm. A formação de dímeros novamente aumentou a absorção molar acima da dos monômeros individuais; notavelmente ε aumentou em ~26.000 M-1 cm-1 (~27%) para a Vênus associada λmax (514 nm) onde há pouca contribuição para sfGFP. Para investigar a comunicação entre os monômeros, foi monitorada a emissão de fluorescência na excitação em quatro comprimentos de onda separados: 400 nm (sfGFP apenas); 450 nm (sfGFP, Vénus menor); 490 nm (sfGFP λmax, Vénus ombro); 510 (Vénus, Vénus menor sfGFP). Em todos os comprimentos de onda de excitação, o único pico de emissão claro estava a 528 nm (Fig. 7b), correspondendo a Vénus indicando comunicação por transferência de energia por ressonância de Förster (FRET). Um pico de emissão correlacionado com sfGFP204SCO (~510 nm) não foi observado mesmo em excitação nos comprimentos de onda inferiores específicos para sfGFP. Também não foi observado o pico de emissão intermediário característico do GFVen148, destacando-se as características inovadoras do heterodímero 148. A diferença mais significativa foi observada na excitação a 400 nm, onde há um aumento de 14 vezes na intensidade de emissão a 528 nm para o GFVen204 em relação ao Vênus204azF (Fig. 7f, inset). A eficiência relativa da FRET calculada após a decomposição espectral foi de cerca de 90%. Assim, os dois centros funcionais estão se comunicando através de transferência de energia (Fig. 7g) de forma altamente eficiente.