shRNA – Aplicações – O que é shRNA, como funciona e suas aplicações.

O que é shRNA e como se usa?

Sequências curtas de RNA (shRNA) são geralmente codificadas num vector de ADN que pode ser introduzido nas células através da transfecção de plasmídeos ou da transdução viral. As moléculas de shRNA podem ser divididas em duas categorias principais com base nos seus desenhos: shRNA simples com haste e shRNA microadaptado. Um shRNA de ciclo-tronco simples é frequentemente transcrito sob o controle de um promotor de RNA Polimerase III (Pol III). A transcrição de 50-70 nucleotídeos forma uma estrutura de ciclo-tronco que consiste em uma região de 19 a 29 bp de RNA de dupla corda (o caule) unida por uma região de RNA predominantemente de uma corda (o laço) e um ressalto de dinucleotídeo 3′. O shRNA de haste simples é transcrito no núcleo e entra na via do RNAi semelhante a um pré-microRNA. O shRNA microRNA adaptado ao longo (> 250 nucleotide) é um desenho que mais se assemelha a moléculas nativas de pri-microRNA, e consiste em uma estrutura de caule de shRNA que pode incluir desajustes do tipo microRNA, ligado por um laço e flanqueado por seqüências de microRNA endógeno de 5′ e 3′. O shRNA adaptado ao microRNA, como o simples grampo de cabelo do laço da haste, também é transcrito no núcleo, mas pensa-se entrar na via do RNAi mais cedo, semelhante a um pri-microRNA endógeno.

shRNA tecnologias são baseadas no DNA, que fornece flexibilidade no projeto do vetor. A maioria dos sistemas shRNA baseados em vetores contém um marcador selecionável para permitir a eliminação de células que não foram transfectadas ou transduzidas com sucesso, e a manutenção de células com derrubamento de genes sustentado. Os cassetes de expressão de shRNA também podem ser incorporados em sistemas vetoriais virais, incluindo retrovírus, vírus adeno-associado, adenovírus e lentivírus, que permitem integração estável e expressão a partir do genoma hospedeiro. Estas estratégias virais permitem o fornecimento de shRNA às linhas celulares que são refratárias à transfecção. Marcadores fluorescentes (como uma Proteína Fluorescente Verde ou Vermelha ) também podem ser incluídos para rastrear células que expressam shRNAs. O desempenho do shRNA é influenciado por muitos factores, incluindo a eficiência da transdução ou da transfecção, a expressão promotora do shRNA e modificações epigenéticas (que podem levar ao silenciamento da expressão do shRNA). Além disso, a influência que cada um destes factores tem no desempenho do vector pode diferir dependendo da linha celular ou do tipo de célula . As opções de promotores e repórteres SMARTchoice estão disponíveis para ajudar os pesquisadores a selecionar promotores ideais para a expressão do shRNA e o silenciamento do gene. Finalmente, quando esses cassetes de expressão de shRNA são acoplados com promotores induzíveis, como com o shRNA lentiviral Inducivel SMARTvector ou o sistema vetorial TRIPZ, os pesquisadores podem projetar estudos para modular temporalmente e espacialmente a expressão gênica .

Video animação: interferência RNA

Como é entregue o shRNA a uma célula?

Existem duas opções de entrega de shRNA baseado em ADN às células. Para plasmídeos, métodos típicos de transfecção, como o uso de reagentes de transfecção lipídica ou electroporação, podem ser utilizados. As partículas lentivíricas são uma excelente escolha para células difíceis de transferir, e em situações em que é necessária uma alta eficiência ou múltiplas construções por célula. A maioria dos vetores modernos tem marcadores selecionáveis que permitem a matança seletiva de células na cultura que não foram transfectadas ou transduzidas com sucesso, de modo que uma cultura pura possa ser desenvolvida.

O que afeta a função e especificidade do shRNA?

Optimal gene knockdown é um requisito para o sucesso do RNAi usando sistemas de shRNA. O design racional das sequências de shRNA tem sido largamente baseado em algoritmos desenvolvidos com siRNA. Enquanto algumas regras de design de siRNA se aplicam ao shRNA, algoritmos de design de shRNA mais refinados irão provavelmente melhorar o silenciamento do gene alvo para shRNAs no futuro . A fim de prever sequências funcionais de shRNA, o algoritmo de shRNA do Dharmacon SMARTvector™ selecciona sequências alvo com base em numerosos critérios, incluindo preferências de nucleótidos dependentes da posição, estrutura secundária e perfis de estabilidade termodinâmica específicos para o andaime baseado em microRNA SMARTvector. Adicionalmente, o algoritmo SMARTvector inclui vários critérios para aumentar a especificidade.

As com siRNAs, as abordagens bioinformáticas podem ser aplicadas para criar shRNAs específicos do alvo enquanto minimiza o potencial para efeitos fora do alvo. Sabe-se que altas concentrações de intermediários silenciosos contribuem para eventos fora do alvo, mas o nível dos intermediários é difícil de controlar quando os shRNAs são exogenamente expressos. Várias publicações têm documentado evidências de que, sob condições específicas, níveis elevados de expressão do shRNA simples do ciclo estaminal podem saturar a via endógena do RNAi, e levar a fenótipos não intencionais. Outros estudos têm sugerido que o uso de um shRNA ajustado ao microRNA pode reduzir a toxicidade celular para experimentos com RNAi in vivo, devido ao processamento mais eficiente desses andaimes tanto pelo Drosha-DGCR8 quanto pelo Dicer .

aplicações de shRNA

shRNA oferece a possibilidade de silenciamento prolongado do gene. A transdução do shRNA de base viral permite o acesso a células, tais como células primárias e neuronais, que são difíceis de serem transfectadas por estratégias tradicionais baseadas em lipídios catiônicos. Os shRNAs de base viral também têm sido usados para avaliar a função gênica em escalas genômicas inteiras usando pools de construções de silenciamento. Telas combinadas ou em matriz são agora amplamente utilizadas para realizar telas de alto rendimento para identificar genes necessários em uma variedade de processos, como sobrevivência e proliferação de células cancerígenas, componentes da via de supressão tumoral, moduladores do relógio circadiano dos mamíferos, supressores da transição mesenquimal epitelial, mediadores do hospedeiro da replicação do HIV-1 e reguladores da migração celular. O poder do rastreio agrupado de RNAi também foi alargado ao rastreio da função genética em modelos animais para investigar a biologia in vivo .

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SMARTvector shRNA lentiviral – Manual Técnico

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GIPZ shRNA lentiviral – Manual Técnico

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1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genómica, biogénese, mecanismo e função. Célula 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogénese: corte coordenado e corte em cubos. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Ciência 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Biotecnologia da Natureza 20(5):505-508.

>

6. Silva, J.M. et al. (2005) Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Análise funcional de vários promotores em vetores lentivíricos em diferentes estágios de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos. Terapia Molecular 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) Uma comparação sistemática das actividades promotoras/ melhoradoras relativas nas linhas celulares de mamíferos. Biochem analítico. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Família Kruppel de factor de transcrição 9, um factor de transcrição associado à diferenciação, suprime a sinalização Notch2 e inibe as células estaminais glioblastómicas iniciadoras. Células-tronco 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji coordena o controle da atividade enzimática PRC2 e a ocupação do gene alvo em células pluripotentes. Célula 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Cytoplasmic FANCA-FANCC complex interage e estabiliza a proteína nucleofosmina leucêmica localizada do citoplasma (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Identificação funcional de gatilhos de RNAi otimizados usando um ensaio de sensor maciçamente paralelo. Célula Molecular 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatalidade em ratos devido à sobre-saturação de microRNA celular/vias curtas de RNA do fio de cabelo. Natureza 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Biotecnologia da Natureza 23(2):227-231.

>

17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC casam microRNA biogenesis e silenciamento genético pós-transcripcional. Célula 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Identificação altamente paralela de genes essenciais em células cancerígenas. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Ciência 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Ciência 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) Uma tela funcional de RNAi em larga escala revela um papel do CK2 no relógio circadiano dos mamíferos. Genes e Desenvolvimento 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 é um regulador negativo da transição epitelial-mesquímica e metástase no cancro da mama. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) Um rastreio de RNA de células T do jurkat para proteínas humanas contribuindo para a replicação produtiva do HIV-1. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) Uma triagem de RNAi em todo o genoma identifica múltiplos reguladores de migração celular dependentes de RSK. Genes e Desenvolvimento 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) Uma tela de RNAi in vivo baseada em oncogenômica identifica os supressores tumorais no câncer de fígado. Célula 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) A inibição terapêutica do miR-208a melhora a função cardíaca e a sobrevida durante a insuficiência cardíaca. Circulação 124(14):1537-1547.