Neste estudo, colocamos a hipótese de que diferentes métodos de isolamento do RNA terão impacto nos resultados ao analisar a expressão do gene nos tecidos. Os métodos de extração do RNA podem ser amplamente caracterizados em fenol: extração clorofórmio seguida por precipitação alcoólica (TRIzol), fenol: clorofórmio seguido por extração em fase sólida (em coluna; miRVana e miRNeasy) e separação em fase sólida com/sem resina de afinidade (Norgen total e Isolate II). Estas metodologias foram desenvolvidas principalmente para a extração de mRNAs longos e foram baseadas no pressuposto de que todos os RNAs são purificados igualmente. Além disso, há uma série de considerações para escolher um determinado método de extração de RNA, tais como a qualidade, quantidade, preço e facilidade de uso (tempo para extração). Aqui, apresentamos dados que mostram o método usado para extrair o RNA também produzirá resultados variáveis em comparação com diferentes métodos em aplicações posteriores e, portanto, é outra consideração importante.
Este estudo demonstra que os métodos de isolamento de RNA variam em termos da quantidade e qualidade das amostras de RNA, e na análise do miRNA e expressão gênica alvo. Escolhemos órgãos que podem ser difíceis de isolar o RNA por diferentes razões. Por exemplo, o isolamento do RNA do cérebro é frequentemente notado como resultando em baixos rendimentos devido ao seu alto conteúdo lipídico. Isto foi particularmente evidente com o kit Bioline Isolate II. O protocolo dos fabricantes sugere que até 5 μg de RNA deve ser purificado a partir de 10 mg de rato/cérebro de rato. No entanto, o manual miRNeasy sugere que 5-20 μg de RNA deve ser alcançável a partir do cérebro com a mesma quantidade de material de entrada. A resolução de problemas no site do fabricante descreve um problema com tecidos ricos em lípidos que está entupindo a coluna e sugere a diminuição da quantidade de amostra ou o aumento do volume do tampão de lise. As nossas extracções foram realizadas dentro dos limites sugeridos pelo protocolo. Subsequentemente, sugerem a realização da pré-extracção utilizando reagente de TRIsure (equivalente da Bioline ao TRIzol) e depois a separação em coluna com o kit para limpar a fase aquosa. Este método seria então comparável aos métodos de extracção de RNA miRVana e miRNeasy e pode resultar em melhores rendimentos para este tecido. Além disso, a qualidade do RNA está correlacionada com as respostas específicas do tecido ao estresse fisiológico antes e depois da morte do tecido. Tecidos como pulmão e fígado têm caracteristicamente baixo RIN e um pequeno pico de 28S, já que estes tecidos são propensos a degradação mais rápida do RNA por altos níveis de nucleases. Para inactivar as nucleases, o tecido é rapidamente congelado e o descongelamento evitado até que o material pesado seja adicionado ao tampão de extracção. Embora o descongelamento do tecido tenha sido evitado, não podemos descartar o tempo desde a eutanásia do animal e excisão dos órgãos até a congelação rápida como fator contribuinte para os baixos valores gerais de RIN e alguns produtos de degradação observados com todas as amostras pulmonares, independentemente do kit de isolamento utilizado. Um método alternativo para inativar nucleases é o uso de uma solução estabilizadora de RNA como o RNAlater (ThermoFisher Scientific), que permite o processamento posterior de amostras de tecido não congelado. Pode ajudar a garantir a integridade do RNA, mas não é compatível com todos os procedimentos de isolamento do RNA e os utilizadores devem verificar o seu método específico antes de efectuarem extracções. A adição de um pico após 60 s em algumas amostras na análise do Bioanalyser sugere contaminação por gDNA. Um tratamento adicional com DNase pode ser realizado em colunas com alguns kits, porém uma etapa de eliminação do gDNA é altamente recomendada durante a etapa de transcrição reversa. A inclusão desta etapa em nossos métodos pode explicar porque não houve interferência na análise da expressão do mRNA das amostras de pulmão de Norgen, mas teve impacto na análise da expressão do miRNA, já que o protocolo de ensaio do miRNA de Taqman não inclui a remoção do gDNA. Além disso, a pureza das amostras de RNA é um fator crítico, pois mesmo que as amostras com RIN > 7 devam ter bom desempenho na maioria das aplicações a jusante, aquelas que envolvem reações enzimáticas como qPCR podem ser inibidas por nucleases, íons metálicos ou contaminantes orgânicos. Em geral, as amostras de RNA do Bioline Isolate II apresentaram rácios 260/230 mais baixos e os contaminantes podem estar contribuindo para o seu mau desempenho. Finalmente, foram observadas diferenças no enriquecimento dos miRNAs na preparação total do RNA. Como os miRNAs representam uma pequena fração do repertório geral de RNA, pode ser difícil determinar sua contribuição a partir da análise de integridade. O ensaio Qubit microRNA oferece uma detecção altamente selectiva de pequenas quantidades de RNA, mesmo na presença de contaminantes comuns. Percentagens elevadas de miRNAs foram normalmente detectadas com métodos de extracção de miRVana e Norgen, contudo dada a análise de integridade para preparações de RNA total de Norgen, é possível que o enriquecimento do miRNA possa estar sobrestimado, uma vez que fragmentos menores de RNA estão a ser detectados após a degradação ou oxidação de RNAs maiores (mRNAs, rRNA ou tRNAs) ou no caso das amostras pulmonares a contaminação de ADN perturbar os resultados do Qubit. Assim, a quantidade, qualidade e pureza das amostras de RNA são fatores altamente importantes para a escolha de um método particular de extração de RNA e mais pesquisas sobre como otimizar esses métodos para seus tecidos de interesse podem ajudar a melhorá-los.
O perfil dos miRNAs pode dar uma visão como biomarcadores para aplicações diagnósticas ou prognósticas. Por exemplo, painéis de miRNAs podem ser usados para classificar diferentes fenótipos cancerígenos, prever a recorrência ou resposta a terapias . No entanto, para a descoberta e aplicação clínica de biomarcadores baseados em miRNA, é necessário optimizar e padronizar as práticas de extracção do RNA para evitar resultados conflituosos. Por exemplo, uma meta-análise de 63 estudos publicados por Zhou et al. (2014) encontrou resultados inconsistentes e até contrastantes ao avaliar o valor prognóstico do oncomiR, miR-21 . Os autores atribuem a heterogeneidade a diferenças na fonte das amostras, nos métodos de detecção e nos métodos de normalização mas não aludiram aos métodos de extração de RNA, o que mostramos também contribuir.
As funções biológicas e alvos de muito poucos miRNA foram validados experimentalmente, mas isto é fundamental para a realização do potencial da terapia baseada no miRNA. Além disso, a descoberta das funções biológicas específicas dos tecidos ajudará a identificar a sua acção terapêutica e potenciais efeitos fora do alvo nos tecidos normais. A validação das interacções miRNA-mRNA é feita principalmente em ensaios de cultura celular, que envolvem a manipulação artificial de miRNA endógenos. No entanto, os níveis alcançados através da manipulação de cultura celular (por exemplo, a transfecção de mímicas) não são normalmente a níveis fisiológicos observados in vivo, portanto, é importante recapitular os resultados em modelos animais apropriados. Atualmente, nenhum relatório comparou diretamente o miRNA e a detecção do gene alvo a partir de amostras totais de RNA usando diferentes métodos de extração. Mostramos que os métodos de extração de RNA diferem em sua eficiência no isolamento de RNA tanto curtos quanto longos e, portanto, deve-se considerar cuidadosamente a escolha de um método apropriado se se deseja detectar ambos a partir da mesma amostra.
Pesquisas anteriores comumente assumiram que todos os tipos de RNA são purificados igualmente. Entretanto, vários relatórios têm surgido indicando diferenças na eficiência de extração dependendo do método utilizado para o isolamento do RNA. Kim et al. (2011) retraíram seu trabalho em Célula Molecular ao descobrir que suas conclusões sobre diferenças na expressão do RNA miRNA a partir de células cultivadas em diferentes confluências (alta densidade versus baixa densidade) e quando elas foram separadas da placa de cultura (aderente versus suspensão) foram na verdade contabilizadas por diferenças na eficiência de extração do RNA usando o método TRIzol . Eles descobriram que miRNAs com baixo conteúdo de GC e estrutura secundária estável foram perdidos durante a extração, em vez de serem degradados nas células como haviam publicado inicialmente . Resultados anteriores de El-Khoury et al. (2016) encontraram diferenças na recuperação do miRNA a partir de células, plasma e exossomos derivados de urina/plasma ao comparar TRIzol LS, soro/plasma miRNeasy e kits de extração de biofluidos miRCURY . Os autores descobriram que o kit miRCURY isolou RNA altamente puro mas recuperou mal os miRNAs, o TRIzol produziu RNA de baixa pureza que teve impacto na eficiência da PCR, enquanto o miRNeasy produziu RNA de baixa qualidade mas realizou o melhor para a detecção do miRNA. Da mesma forma, McAlexander et al. (2013) encontraram diferenças na extração do miRNA do plasma e do líquido cefalorraquidiano. Eles compararam miRVana, miRCURY Cell and Plant kit e extrações de TRIzol LS com e sem glicogênio como portador. miRVana era similar com ou sem glicogênio, enquanto miRCURY sem glicogênio teve uma recuperação de miRNA ligeiramente menor do que miRVana. No entanto, o glicogênio melhorou muito a recuperação do miRNA com o kit miRCURY, mas exacerbou o baixo rendimento e a variabilidade com a extração do TRIzol. Em seguida, compararam o miRCURY Cell and Plant kit com o miRCURY Biofluids e os métodos de extração de soro/plasma miRNeasy com o glicogênio como portador e descobriram que o miRCURY Biofluids tinha a maior abundância relativa de miRNA exógeno spiked-in e concluíram que este era o método superior para a sua aplicação particular. Coletivamente, estes estudos destacam as diferenças na recuperação do RNA utilizando diferentes métodos de extração e sugerem a necessidade de otimizar para sua célula, tecido e/ou fluido de interesse.
Existem várias etapas durante o fluxo de trabalho que podem introduzir variação experimental. Começando com o método de fixação ou congelamento do tecido, armazenamento do material, método de extração de RNA, método utilizado para transcrição reversa e amplificação qPCR ou outras plataformas a jusante. Neste estudo tentamos controlar algumas destas variáveis através da congelação flash dos tecidos, armazenamento a – 80 °C, evitando o descongelamento antes da extração e utilizando as práticas mais recomendadas para a análise da expressão do miRNA. Por exemplo, o uso de primers RT específicos de sequência em oposição a um primer RT universal mostrou-se superior para amplificação de produtos específicos . qPCR é considerado o padrão ouro para análise de miRNA e expressão alvo devido à sua sensibilidade e especificidade sobre plataformas de perfilagem global. Importante, a qualidade dos resultados obtidos é mais importante do que o número de miRNAs perfilados a partir de grandes plataformas baseadas em sequenciamento. Além disso, embora não tenhamos comparado o efeito do enriquecimento de miRNA das nossas amostras de RNA, os relatórios anteriores desaconselharam-no, particularmente para plataformas globais de perfilação de miRNA. Por exemplo, Redshaw et al. (2013) descobriram que o procedimento curto de enriquecimento de RNA resulta em níveis de miRNA significativamente menores quando comparamos o total de RNA e material enriquecido, especificamente o procedimento de enriquecimento reduziu o número de cópias de miRNA em até 25% do presente das amostras pré-enriquecidas e que esta perda variou para diferentes sequências de miRNA. Portanto, os dados de miRNA das preparações de RNA total e curto podem não ser diretamente comparáveis. Além disso, foi sugerido que RNA maior pode atuar como um portador para RNAs pequenos. Se os métodos enriquecidos de RNA miRNA para todas as empresas resultariam em uma melhor recuperação dos tecidos permanece por determinar. Embora a Bioline sugira um kit separado para isolamento de RNA miRNA, usamos o kit Isolate II total de RNA para comparar diretamente com outros métodos de extração, pois o kit específico de RNA miRNA não permite o isolamento de RNAs curtos e longos da mesma eluição. Em vez disso, as espécies de RNA miRNA são primeiro enriquecidas e isoladas, e depois podem ser extraídos RNAs longos, resultando em duas fracções separadas. Embora o Isolado II não seja otimizado para isolar pequenos RNAs como os kits miRVana ou miRNeasy, ele também não foi superior para a expressão do gene alvo. Dada a grande discrepância entre certos kits, os pesquisadores deveriam optar por um método de extração mais robusto.