Problemas iniciaisEditar
TermolabilityEditar
Aplicação inicial da recombinação FLP-FRT não funcionou em mamíferos. A proteína FLP foi termolabílica (desnaturada a temperaturas elevadas) e, portanto, não foi útil no modelo mamífero devido às temperaturas corporais elevadas destes sistemas modelo. Entretanto, devido às patentes e restrições ao uso da recombinação Cre-Lox, foi demonstrado grande interesse em produzir um cassete FLP-FRT mais termoestável. Alguns dos primeiros resultados foram produzidos por Buchholz et al. (1997), utilizando a mutagênese cíclica na Escherichia coli . Em suas pesquisas, os autores transfectaram células de E. coli com dois plasmídeos: um codificador para as proteínas FLP com mutação aleatória a jusante de um promotor de arabinose e outro contendo um promotor do gene lacZ dentro de um cassete de FRT. As E. coli foram cultivadas em placas de arabinose a 37 °C e 40 °C, e se ocorresse recombinação, a expressão lacZ seria atenuada, e as colônias apareceriam brancas. As colónias brancas foram seleccionadas de cada geração e cultivadas em novas placas de arabinose às mesmas temperaturas anteriores durante oito gerações. Após a recombinação ter sido confirmada por manchas ocidentais e os genes FLP mutantes terem sido sequenciados, esta oitava geração de proteína FLP (FLPe) foi transformada em cultura de células de mamíferos, e a recombinação em células de mamíferos foi confirmada. Esta variante da FLP tem apenas 4 substituições de aminoácidos: P2S, L33S, Y108N, e S294P.
Geração de mosaicos genéticosEditar
Mosaicismo genético ocorre dentro de um organismo quando tipos celulares similares expressam fenótipos diferentes devido a genótipos diferentes em loci específicos. Simplificando, isto ocorre quando um organismo contém genótipos diferentes, o que normalmente é raro na natureza. Contudo, isto pode ser facilmente (e problematicamente) produzido usando a recombinação FLP-FRT. Se dois locais FRT diferentes estiverem presentes dentro de uma célula, e o FLP estiver presente em concentrações apropriadas, o cassete FRT continuará a ser excisado e inserido entre os dois locais FRT. Este processo continuará até que as proteínas FLP fiquem abaixo das concentrações requeridas resultando em células dentro de um organismo que possua genótipos diferentes. Isto tem sido observado desde moscas da fruta até ratos e é indiscriminado contra cromossomos específicos (somático e sexo) ou tipos celulares (somático e linha germinal).
Determinação de linhagens celularesEditar
Antes da publicação de Dymecki et al. (1998), a recombinase Cre recombinase tinha sido usada para o mapeamento de células de progenitores neuronais em ratos usando o promotor En2. Assim, os autores de Dymecki et al. (1998) teorizaram que a recombinase FLP poderia ser utilizada de forma semelhante com eficácia semelhante à recombinase Cre em camundongos. Os autores criaram duas linhas de ratos transgênicos: uma linha de fusão neuronal Wnt1::Flp e uma linha que possuía o cassete FRT flanqueando o 18º exon do tm1Cwr. Os autores escolheram este exon para a excisão porque se for excisado, o resultado é um fenótipo nulo. Os autores cruzaram as duas linhas e permitiram que a descendência chegasse à idade adulta antes que a descendência fosse sacrificada. A extração do RNA foi realizada em tecido neuronal, muscular, entérico e caudal. A PCR de transcrição reversa e o blotting norte confirmaram a excisão do 18º exon do tm1Cwr abundantemente no tecido cerebral e moderadamente no tecido muscular (devido às células Scwhann dentro do músculo). Como esperado, a excisão não foi observada em outros tecidos. Os autores viram eficiência igual, se não melhor, da recombinase FLP na determinação da fração celular do que na recombinase Cre.
Em Drosophila melanogaster (Fruit Fly)Edit
Até hoje, a recombinase Flp tem sido utilizada muitas vezes em D. melanogaster. Uma comparação da recombinase Flp com a recombinase Cre em D. melanogaster foi publicada por Frickenhaus et al. (2015). Os autores de Frickenhaus et al. (2015) tinham um duplo objetivo: caracterizar e comparar a eficácia da recombinase Flp “knock-out” com a recombinase Cre “knock-out” e RNAi knock-down e revelar a função da cabeza (caz), o ortograma da mosca para FUS, nos neurônios e tecido muscular de D. melanogaster. O FUS tem sido fortemente implicado na esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência frontotemporal em humanos . Os autores utilizaram um sistema elav-Gal4/UAS-Flp ou Cre para expressar a recombinase especificamente nos neurônios e um sistema Mef2-Gal4/UAS-Flp ou Cre para expressá-la especificamente nos músculos. Os autores concluem que a ferramenta de recombinase Flp “knock-out” é mais eficaz que a recombinase RNAi e Cre, com o propósito de derrubar genes específicos em tecidos ou linhas celulares específicas, devido à falta da expressão vazada observada tanto na transcrição da proteína Cre quanto na do RNAi. Além disso, os autores testemunharam uma toxicidade à proteína Cre que não é vista com a proteína Flp.
Em Danio rerio (Zebrafish)Edit
A eficácia do sistema de recombinase FLPe foi avaliada em zebrafish por Wong et al. (2009). Embriões, que eram hemizigotos para uma proteína fluorescente verde melhorada (EGFP) flanqueada a jusante de um promotor específico do músculo, foram injetados com a proteína FLPe. Sem a FLPe, esses embriões devem expressar a EGFP em todo o tecido muscular e, se cruzados com um cordão do tipo selvagem, 50% da progênie resultante também deve expressar a EGFP no tecido muscular. Os embriões, injetados com FLPe, tinham expressão significativamente reduzida de EGFP no tecido muscular, e o mosaicismo também foi observado. Quando estes embriões atingiram a idade adulta, foram acasalados com uma linhagem de tipo selvagem, e as ninhadas resultantes tiveram significativamente menos progenitura que expressava o EGFP no tecido muscular (0-4%). Estes resultados mostram, que não só o FLPe é altamente eficaz em células somáticas, como é altamente eficaz na linha germinal do zebrafish, também,
Em plantasEdit
Criação de “phytosensors” ou “sentinels” em Arabidopsis thaliana e TobaccoEdit
Phytosensors são plantas geneticamente modificadas que podem relatar a presença de contaminantes bióticos ou abióticos. Obviamente, a produção destas plantas artificiais tem uma grande promessa agrícola e laboratorial. No entanto, a criação de um vetor relator apropriado mostrou-se problemática. Os elementos cis-regulatórios desempenham um papel importante na ativação transcripcional dos genes nas plantas, e muitos não são bem compreendidos. Muitos fitoensores ou expressam seus genes ou relatam falsos-positivos devido a promotores sintéticos. Os autores de Rao et al. (2010) utilizaram a ferramenta de recombinação FLP para a produção de um fitoensensor altamente eficiente. Os autores utilizaram um promotor de choque térmico para induzir a produção de FLP enquanto um vector flanqueado por FRT separava o promotor CaMV 35S do gene da beta-glucuronidase (GUS). Quando as plantas foram expostas ao choque térmico, a indução de FLP levou à excisão do vetor flanqueado pela FRT, movendo efetivamente o gene GUS diretamente a jusante do promotor CaMV 35S. A ativação do GUS levou as folhas das plantas a mudarem de verde para azul; assim, o fitosensor efetivamente relatou estresse ao sistema modelo!
Com Cre-recombinaseEdit
Produção do sistema de expressão MiRNA (GRIM) de porta de entrada induzívelEdit
Interferência RNAi (RNAi) causou uma mudança de paradigma na expressão dos genes e potenciais nocaute de genes em Eukaryotes. Antes da produção do sistema de expressão GRIM, a criação dos vetores RNAi era cara e demorada. Os vetores eram produzidos pelo método tradicional de clonagem molecular copy-and-paste. Garwick-Coppens et al. (2011) desenvolveram um método muito mais eficiente para a produção de vetores de RNAi, no qual a expressão do RNAi pode ser derrubada usando Cre-recombinase e derrubada usando Flp-recombinase. O novo GRIM Expression System permite a geração muito mais rápida de vetores de expressão contendo construções artificiais de RNAi. Os autores continuaram a mostrar que seu sistema de expressão funciona de forma bastante eficaz em células embrionárias humanas (HEK), uma linha celular imortalizada humana comum em pesquisa molecular.