26.3.1.1 Os Receptores T1R: Transdução de Qualidades de Gosto Doce e Umami
Os primeiros receptores metabótropos identificados na gustação foram dois membros da família T1R, T1R1 e T1R2 (originalmente chamados TR1 e TR2),41 e foram descobertos por técnicas de triagem subtrativa e diferencial de célula única. Estes receptores apresentam cerca de 40% de homologia entre si e estão distantemente relacionados com outros GPCRs, como o receptor sensível ao cálcio, o receptor de feromona V2R e os receptores de glutamato metabótropo. Todos são membros da família GPCR classe C e compartilham a característica distintiva de um domínio extracelular N-terminal longo conhecido como o domínio da armadilha de mosca de Vênus. Experiências de hibridação in situ estabeleceram que esses receptores são expressos em 20-30% dos TRCs nas papilas gustativas anterior e posterior. Além disso, eles estão presentes em quase todos os vertebrados, mas não em invertebrados.39
Inicialmente, os ligandos para estes receptores eram desconhecidos, embora com base na sua expressão na língua anterior, a transdução doce tenha sido sugerida. Muitos especularam que os genes desses receptores seriam mapeados no locus sacro, uma região no cromossomo distal 4 previamente identificada por estudos genéticos para estar envolvida com o gosto doce em camundongos. Fuller,42 estudando cepas de camundongos que diferem em sua avidez para consumir soluções doces, estabeleceu que a maioria das diferenças na preferência pela sacarina nas cepas de sabor e não sabor (C57BL/6J e DBA/2J, respectivamente) dependia de um único locus, denominado saco. A forma dominante do alelo está correlacionada com a preferência mais aguda. Estudos posteriores generalizaram esse achado para moléculas doces adicionais, como acessulfame, dulcina e sacarose,43,44 e observaram que polimorfismos putativos nos genes influenciaram a atividade nervosa periférica.45 Entretanto, usando o mapeamento genético de alta resolução, o T1R1 mapeou proximal ao locus do saco.46
A identidade do saco e sua relação com a família de receptores T1R tornou-se clara quando o terceiro membro da família, T1R3, foi descoberto.47-49 T1R3 é expresso tanto em campos anteriores quanto posteriores em TRCs cuja morfologia é consistente com células do tipo II. É coexpressa com T1R1 ou T1R2, apesar de uma fração de T1R3 – TRCs coexpressores não coexpressos.50 As células T1R3 são coexpressas com outros elementos da cascata de transdução doce que incluem α-gustducin e PLCβ2. Experimentos utilizando sistemas de expressão heterólogos demonstraram que T1R3 requer que a coexpressão de T1R2 seja totalmente responsiva a uma grande variedade de substâncias doces, como açúcares simples, adoçantes artificiais, d-aminoácidos e proteínas doces.48,51 O dímero humano T1R2/T1R3 respondeu a cerca de vinte compostos conhecidos por serem doces em concentrações fisiológicas e foi inibido por lactisole, um antagonista do sabor doce humano.51 Através de uma combinação de mapeamento físico e mineração de banco de dados genômico, vários grupos identificaram um T1R3 como saco em genomas roedor e humano.47-49,51-54
Validação de T1R2/T1R3 como o principal receptor de sabor doce de mamífero foi obtido a partir de estudos usando ratos knockout para os genes T1R1, T1R2, ou T1R3, bem como um rato knockout duplo para os genes T1R2 e T1R3. Esses camundongos foram testados usando breves ensaios comportamentais de acesso e registros eletrofisiológicos de cordas timpânicas e nervos glossofaríngeos.55,56 Camundongos T1R2-nulos apresentaram perda de preferência e respostas neurais para edulcorantes artificiais e grande diminuição das respostas para açúcares naturais. Os camundongos T1R3-nulos perderam respostas comportamentais e eletrofisiológicas tanto para os estímulos umami quanto para os adoçantes artificiais e tiveram respostas muito diminuídas para os açúcares. Somente o animal com dupla nocaute perdeu completamente as respostas residuais aos açúcares naturais, sugerindo que T1R2 ou T1R3 pode operar como um monômero ou um homodímero. De fato, células HEK-293 expressando apenas o rato T1R3 responderam a açúcares elevados;50 curiosamente, estas respostas não foram observadas com o T1R3 humano. Estes estudos knockout demonstraram inequivocamente o papel essencial das proteínas T1R T1R2 e T1R3 na detecção e percepção do doce. Da mesma forma, em um knockout natural fascinante, a família Felidae adquiriu uma mutação de perda de função no gene T1R2 no início da evolução e consequentemente perdeu o gosto doce, explicando a indiferença dos gatos pelo açúcar.57
Como poderiam tão poucos receptores doces explicar o grande número de espécies e diferenças individuais na percepção do gosto doce? Essas diferenças podem ser explicadas por diferenças nas sequências genéticas entre espécies e por polimorfismos dentro de uma espécie. Em expressão heteróloga, apenas o T1R2/T1R3 humano respondeu ao aspartame e ciclamato, enquanto os receptores do rato, que é indiferente a estes compostos, não o fizeram.51 Mais notavelmente, o rato T1R2-nulo expressando o transgene T1R2 humano mostrou respostas a várias moléculas reconhecidas como doces pelos humanos, às quais os ratos são indiferentes.55 Dentro de uma espécie, múltiplos polimorfismos de várias linhagens de camundongos claramente afirmam o status de provador e não provador desses animais.54,58 Esses polimorfismos não agem bloqueando a expressão gênica ou a tradução de proteínas, mas são considerados como interferindo na capacidade de formar dímeros ou ligar adoçantes. Em humanos, os polimorfismos associados ao promotor T1R3 ajudam a explicar as conhecidas diferenças na sensibilidade gustativa à sacarose.59
Outro paradoxo emergente da descoberta de receptores doces é como tão poucos receptores podem reconhecer uma gama tão diversa de estímulos como carboidratos, aminoácidos, proteínas e edulcorantes artificiais. Estudos de estrutura-função desses receptores identificaram múltiplos domínios de ligação dentro do complexo dimer, o que explica como essa grande diversidade pode ser atendida.60,61 Por exemplo, o domínio flytrap Vênus de T1R2 é necessário para a ligação do aspartame e neotame, o domínio transmembrana de T1R3 é necessário para o ciclamato,62,63 e a região rica em cisteína de T1R3 é necessária para responder à brazzeína da proteína doce.64 A lactisole, um antagonista doce, liga-se a uma bolsa dentro do domínio transmembrana do T1R3 humano;65 curiosamente, a mudança de dois aminoácidos no domínio transmembrana 5 do receptor do rato explica sua insensibilidade a este antagonista.66 Até o momento, todos os quatro domínios do dímero T1R2/T1R3 – os dois domínios N-terminais e os dois domínios transmembrana – foram implicados na ligação dos ligandos, cada um com afinidades distintas com seus ligandos correspondentes.
Muitas das mesmas estratégias experimentais que confirmaram T1R2/T1R3 como o receptor doce confirmaram similarmente T1R1/T1R3 como o receptor umami. Quando expresso heterologicamente, o dímero humano T1R1/T1R3 responde seletivamente ao l-glutamato,51 enquanto o dímero do mouse é mais promíscuo entre seus ligandos, respondendo a praticamente todos os enantiômeros l- (mas não d-) dos 20 aminoácidos padrão.48,67 Estudos Knockout documentam ainda o dímero T1R1/T1R3 como o receptor umami. Os estudos Knockout de T1R1 ou T1R3 eliminaram respostas comportamentais e eletrofisiológicas ao glutamato.55 Além disso, uma característica do gosto umami é sua potencialização por ribonucleotídeos como o inosina 5′-monofosfato (IMP) e guanosina-5′-monofosfato (GMP). Esta potenciação é observada de forma semelhante na expressão heteróloga e ausente nos ratos T1R1 ou T1R3 knockout. Em contraste com o receptor de sabor doce, os domínios funcionais do receptor umami são menos explorados. Usando receptores quiméricos, mutagênese dirigida ao local e modelagem molecular, um modelo cooperativo de ligação ligante foi proposto onde o glutamato se liga ao domínio flytrap de Vênus T1R1 (próximo à região da dobradiça) e o IMP se liga a um local adjacente estabilizando a mudança conformacional.68
Ainda há debate se o dímero T1R1/T1R3 é o único receptor funcional de glutamato nos TRCs.50,69 Antes da descoberta da família T1R, uma forma truncada única do receptor mGluR4 expressa em TRCs foi relatada como o receptor umami.70 No entanto, foi apontado que este receptor está faltando uma grande parte do domínio flytrap Vênus, que é essencial para a ligação do glutamato, e carece de sinergia para glutamato e ribonucleotídeos.50 Estas características fazem com que seja menos provável que seja um receptor candidato para umami. No entanto, a dificuldade de dissociar as respostas de sódio e glutamato do MSG, as respostas umami residuais em alguns ratos nocturnos T1R3,56 e a redução das respostas de glutamato aos antagonistas do mGluR71 deixam em aberto a questão dos múltiplos receptores umami.