Regulação da motilidade pelo par central
Mudanças de motilidade em resposta a estímulos externos podem assumir uma de duas formas. O estímulo pode alterar a frequência da reorientação aleatória, como ocorre nas bactérias, de modo que a motilidade em uma direção favorável seja recompensada, ou o estímulo pode regular diretamente a motilidade de modo que o organismo gire em uma direção definida em relação ao estímulo (em direção ao estímulo para táxis positivos, longe para táxis negativos). Tal manobra requer receptores localizados que possam funcionar como uma antena, e um aparelho de motilidade que possa ser controlado direcionalmente (Foster e Smyth, 1980). Uma simples regulação do tipo stop-reorient-start não requer uma regulação sofisticada da motilidade. Em flagella, o controle direcional requer mudanças coordenadas na forma de onda e freqüência de batida e, portanto, um aparato regulatório mais sofisticado. O sistema central de par de raios raios cumpre esse papel em 9+2 cílios e flagelos, como demonstrado mais elegantemente em Clamidomonas (Fig. 1D). Esta alga biflagelada unicelular responde a estímulos fototácticos alterando a forma de onda relativa, a velocidade do golpe e a frequência de batimento dos seus dois flagelos (Witman, 1993). As evidências disponíveis indicam que a fototaxia envolve uma via de transdução de sinal do aparelho central, através de raios radiais, para um complexo regulador duplamente associado, que então modifica o padrão de atividade da tinina e, portanto, de formação e propagação da curva através de mudanças nas kinases proteicas associadas à tinina e fosfatases (Porter and Sale, 2000; Smith and Yang, 2004).
Embora possa ter havido mais de uma maneira possível de formar um aparelho central assimétrico, uma construída sobre um andaime mínimo de dois microtubos pode ter sido a primeira a evoluir e exigiria uma alteração mínima do protocílio, principalmente a adição de um novo local de início de montagem na zona de transição, juntamente com uma estrutura (raio radial) para transmitir sinais do aparelho central para as tinturas associadas à dupla. Imaginamos que os raios radiais evoluíram a partir da regulação de corneína em folhas de doublets, onde interagiram nas suas bases com um complexo regulador de corneína associada a duplo e nas suas pontas com proteínas associadas a microtubos em outra linha de doublets ou em um citoesqueleto de microtubos de cortical singlet. Parece notável, dada a probabilidade de que as dieminas flagelares tenham evoluído a partir de dieminas citoplasmáticas, que nenhum mecanismo regulador comum seja conhecido para estas duas famílias de dieminas. No entanto, isto pode refletir nossa atual falta de conhecimento ao invés de uma ausência de mecanismos conservados. A análise molecular recente de uma proteína do complexo regulador da clamidomonas dynein revelou uma estrutura primária que tem semelhanças com as proteínas citoplasmáticas, mas uma relação com a citoplasmica dynein não foi estabelecida (Rupp e Porter, 2003).
Figurando padrões específicos de interação entre projeções do par central de microtubos e raios radiais que provocam mudanças específicas na atividade da dynein permanece um grande quebra-cabeça. Resultados recentes do nosso laboratório, incluindo a análise da estrutura normal do par central, caracterização dos mutantes defeituosos do conjunto do par central e determinação da orientação do par central durante a propagação da curva, modelos de restrição de como o CP regula a dispneína. Aqui tentamos sintetizar uma hipótese de regulação do par central consistente com estes resultados.
Microscopia electrónica anterior de secção fina de Chlamydomonas e Tetrahymena axonemes, juntamente com preparações de coloração negativa de complexos de pares centrais de Tetrahymena cilia (Chasey, 1969) e flagelos de esperma de rato (Olson e Linck, 1977) revelaram a estrutura assimétrica dos complexos de pares centrais e definiram o microtubo CP com projecções mais longas em secção transversal e periodicidade de 32 nm como C1, enquanto que o outro (C2) tem projecções mais curtas com apenas 16 nm de repetição. Comparando secções transversais e longitudinais finas de complexos de pares centrais do tipo selvagem com complexos de pares centrais de mutantes de montagem pf6 e cpc1, determinei as relações estruturais e períodos de repetição para a maioria das projecções associadas a C1 e C2 em Chlamydomonas. Vistas de superfície fornecidas por imagens estéreo de congelamento rápido, preparações de gravura profunda confirmaram e expandiram essas conclusões e resultaram numa reconstrução 3-d bastante completa do par central (Mitchell, 2003a). Estes estudos fornecem um modelo de potenciais locais de interacção dos raios no par central, e em particular mostram descontinuidades na superfície cilíndrica do PC ao longo das superfícies do microtubo que estão viradas para as cabeças dos raios adjacentes. Também é enfatizada a assimetria geral do complexo CP, o que sugere interacções únicas dos raios em diferentes posições radiais em torno do cilindro CP. A clonagem dos genes pf6 (Rupp et al., 2001) e cpc1 (Mitchell e Sale, 1999; Zhang e Mitchell, 2004) e a identificação dos seus produtos genéticos não identificaram candidatos óbvios para proteínas que interagem com os raios radiais, mas uma proteína parecida com a kinesina (Klp1) no microtubo C2 (Bernstein et al., 1994) é um candidato atraente para uma proteína de ligação do raio. Mostramos recentemente que flagelos nas células Klp1 batem com frequências dramaticamente reduzidas (Mitchell e Yokoyama, 2003).
EM estudos mostram que o PC mantém uma orientação fixa com respeito ao corpo celular e duplos externos em alguns organismos, enquanto em outros o PC tem uma orientação variável. Flogeneticamente, uma orientação fixa parece ser uma simplificação derivada em organelas que têm um plano de curvatura fixo, como a placa de pente cilia ctenóforo (Tamm e Tamm, 1981) e muitos espermatozóides metazoários (Sale, 1986). Em exemplos extremos, os microtubos C1 e C2 são fixados aos doublets 8 e 3, respectivamente, por elos permanentes (seja por raios modificados, seja por estruturas acessórias). No extremo oposto estão cílios e flagelos de organismos unicelulares que dependem de mudanças rápidas na forma de onda, freqüência de batidas e orientação eficaz do curso para responder a sinais ambientais. O PC nestes organelos são torcidos, de modo que não mantêm uma orientação fixa da base à ponta dentro dos 9 doublets circundantes. Além disso, estes PC torcidos giram durante a propagação da curva (Omoto et al., 1999). Mostramos recentemente que o Chlamydomonas CP é orientado paralelamente ao plano da curva dentro de cada curva (Fig. 1D), e gira 180° entre as sucessivas curvas principal e reversa, e que o microtubo C1 está sempre mais próximo dos duplos do lado externo de cada curva (Mitchell, 2003b). Esta orientação constante do PC em relação a uma curva em Clamidomonas permite que um conjunto de projecções do PC interaja com os raios radiais ligados aos doublets com corantes activos, enquanto outro conjunto de projecções do PC interage com os raios radiais nos doublets com corantes inactivos.
Embora o envelope da batida seja quase plano em Clamidomonas, e a direcção das curvas principais não mude drasticamente a partir de um plano constante, isto não é verdade em outros organismos. Se a orientação do PC também segue a orientação da curva nesses outros organismos, como proponho, então o PC está sempre posicionado para proporcionar um controle flexível da motilidade. Os nossos resultados recentes indicam que a orientação do PC se conforma passivamente às curvas que se formam na base de uma Chlamydomonas flagellum, e depois esta orientação dependente da curva transloca à medida que cada curva se propaga da base para a ponta. Uma analogia da engenharia é uma engrenagem sem-fim, na qual a rotação do sem-fim (par central) é introduzida no movimento perpendicular (propagação da curva) das engrenagens interdigitantes de uma engrenagem dentada (curvas axonemais). A direção de uma curva principal, portanto, não pode ser determinada pela orientação do par central, que se conforma passivamente às curvas, mas deve ser regulada no nível duplo externo, através de padrões de iniciação na base flagelar. Os sinais reguladores do PC podem então determinar a forma e a frequência do batimento através da modulação directa dos padrões de actividade da tintura dentro das curvas de desenvolvimento e de propagação. Esta hipótese é consistente com os resultados da reorientação vibracional do plano de batimento dos axonemas de ouriço-do-mar (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Se o novo plano de dobra induzido pela vibração força uma nova orientação do par central, então o relaxamento do sistema após a remoção da vibração imposta destas células exigiria uma rotação gradual do par central de volta à sua posição de repouso. Infelizmente, a informação sobre a orientação real do PC não foi obtida nessas experiências. Esta hipótese também é consistente com o padrão de deslizamento do doublet observado em Chlamydomonas axonemes tratadas com protease, em que os padrões de deslizamento do doublet mantêm uma relação constante com a orientação do par central (Wargo e Smith, 2003; Wargo et al, 2004), e com estudos da atividade de tinturas em Chlamydomonas perturbadas (Smith, 2002) e ouriço-do-mar (Yoshimura e Shingyoji, 1999; Nakano et al., 2003) axonemas, que mostram modulação da atividade dependente do cálcio e do par central.
De que valor preditivo são estas especulações sobre a evolução de cílios e flagelos? Em primeiro lugar, colocamos a hipótese de que a evolução da motilidade da superfície flagelar é primitiva e provável de ser encontrada de forma ampla, mesmo em derivados ciliares do que não batem. Claramente o IFT é uma motilidade essencial e universal para a montagem de organelas móveis e não móveis, por isso a ligação desta maquinaria ao movimento extracelular pode estar igualmente disseminada. Em segundo lugar, o sequestro de receptores nas membranas ciliares também é primitivo, e provavelmente será uma grande pressão seletiva para a continuação da existência de cílios primários não móveis, bem como cílios mais altamente modificados dos órgãos sensoriais. Como os derivados ciliares fornecem funções essenciais em neurônios sensoriais de muitos organismos, apenas um pequeno salto da imaginação é necessário para sugerir que o protocilium também formou a plataforma ancestral para todos os processos sensoriais, e que características adicionais desta organela podem ser comuns em cascatas de transdução sensorial. Terceiro, a orientação do centrossoma como indicador da polaridade celular e da direção da migração das células móveis é também muito primitiva. Se assim for, a importância do protocilium como um determinante precoce da polaridade celular e da migração dirigida sugere que mais ligações devem ser procuradas entre mecanismos que determinam a polaridade celular e mecanismos que orientam os centrosomas/centríolos juntamente com a matriz de microtubulos citoplasmáticos. Finalmente, a regulação de cílios e flagelos pelo par central também deve ter se desenvolvido muito cedo na evolução eucariótica, antes da radiação de todos os filamentos eucarióticos existentes. Embora existam sem dúvida diferenças na regulação detalhada exigida por estas organelas em diferentes organismos e tipos celulares, devemos esperar encontrar muitos traços universais na forma como as interações entre o par central e o rádio regulam a atividade da dienoína, e ainda podem encontrar temas comuns na regulação dos motores axonemal e citoplasmáticos da dieno.