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Resultados Representativos

A capacidade dos ensaios de placa para avaliar com precisão os títulos virais depende de numerosos factores: selecção apropriada da célula hospedeira, meios adequados e condições de crescimento para a viabilidade celular e viral, propagação viral imobilizada, e uma determinação precisa do período de incubação viral para permitir um tempo adequado para a formação de placas distintas e contabilizáveis.

Para este estudo, foram escolhidos vírus de três famílias representativas para demonstrar diferenças em: seleção de sobreposição, períodos de incubação e morfologia da placa em diferentes tipos de amostra. A Encefalite Equina Venezuelana (VEEV) foi selecionada como um modelo viral (+)ssRNA, que pode causar doença significativa em espécies equinas e humanos e representa a família Togaviridae. A cepa Influenza B Taiwan, um vírus (-)ssRNA segmentado que infecta principalmente humanos, representa a família Orthomyxoviridae. O vírus da febre do Vale do Rift (RVFV), um vírus (-)ssRNA nascido de artrópodes que infectam principalmente artrópodes, ruminantes e humanos, foi selecionado como um representante da família Bunyaviridae.

Para o RVFV (Figura 1), os títulos foram determinados a partir de uma solução de reserva de uma cepa MP12 recombinante atenuada viva de RVFV no formato de 12 placas de poços utilizando CMC, agarose, ou sobreposições de Avicel que foram incubadas lado a lado para 72 h de pós-infecção (hpi). Uma placa representativa mostrando diluições que variam de 10-4 a 10-7 pode ser vista no Painel A. Placas usando CMC e sobreposições de agarose mostraram placas pequenas, claras e distintas com uma borda circular bem definida. As placas com uma sobreposição líquida eram ligeiramente mais abundantes e maiores em comparação com as placas de agarose e CMC, e forneciam uma borda menos distinta. Os títulos virais foram comparados no Painel B com todas as sobreposições com desempenho comparável.

A fim de obter uma comparação visual mais clara entre as sobreposições para MP12 juntamente com um tamanho de amostra maior para determinar a reprodutibilidade, uma placa de 6 poços também foi triplicada (Figura 2). No formato de 6 placas de poços, o uso de uma sobreposição de CMC mostrou placas menores do que as de agarose ou líquido, que eram comparáveis em tamanho umas às outras. Enquanto os títulos virais eram semelhantes entre as três sobreposições (Painel D), as placas formadas em agarose e sobreposições líquidas se mostraram mais fáceis de contar devido ao seu tamanho aumentado.

Em contraste com os títulos RVFV, os títulos VEEV e a morfologia da placa entre as diferentes sobreposições variaram acentuadamente (Figura 3A). As placas formadas nas sobreposições de CMC demonstraram uma morfologia clara e distinta ao utilizar um formato de 12 placas de poços, em detrimento do tamanho e sensibilidade da placa (Painel B). Em contraste com o CMC, o uso de agarose e sobreposições líquidas resultou em placas significativamente maiores, indicando menor inibição viral e maior sensibilidade à replicação de VEEV. Isto foi previamente confirmado quando comparamos apenas a agarose com o CMC em um artigo publicado por Juarez et al.4. Enquanto a agarose e as sobreposições líquidas produziram placas maiores do que o CMC, as placas tinham bordas mal definidas e eram difíceis de contar em um formato de 12 poços, com sobreposições líquidas proporcionando a maior difusão das bordas. Quando as placas foram triadas em 6 placas de poços (Figura 4), o formato maior de 6 poços negou a questão das placas de grandes dimensões que eram difíceis de diferenciar no formato de 12 poços, com as sobreposições de agarose e líquidos se mostrando superiores às sobreposições de CMC em termos de definição da placa e sensivelmente (Figura 4D).

Em comparação com RVFV ou VEEV, o Influenza fornece vários desafios únicos quando a placa é usada, tais como a necessidade de uma protease externa. A sensibilidade do vírus influenza a diferentes seleções de sobreposição também foi bem documentada no passado, pois mudanças significativas foram notadas quando modificações tão pequenas quanto marcas diferentes de agarose foram usadas9.

Interessantemente para a cepa Influenza B Taiwan, o uso do CMC como sobreposição resultou em placas marcadamente menores que eram difíceis de contar e provaram ser difíceis de pontuar de forma confiável (Figura 5A). O uso de uma sobreposição de agarose forneceu as melhores placas (Painel C), e resultou em uma coloração de fundo mais escura (provavelmente devido ao aumento da viabilidade da monocamada), e mostrou placas mais claras e nítidas em comparação direta com o uso da sobreposição líquida (Painel B).

Uma vantagem distinta dos polímeros líquidos sobre as sobreposições sólidas e semi-sólidas, como a agarose e o CMC, reside na facilidade de remoção e aplicação. As sobreposições semi-sólidas requerem aquecimento, e a solidificação pode ser problemática no manuseio e na remoção. A fim de capitalizar estas vantagens e determinar a praticidade de utilizar Avicel de uma maneira de alto rendimento para RVFV, um formato de 96 placas de poços foi testado em concentrações variáveis de sobreposições (Figura 6). Para RVFV MP-12, foram realizadas diluições em quadruplicado, tanto em 0,6 como em 1,2% das concentrações finais de Avicel. A aplicação e remoção de overlay mostrou-se simples, sem diferenças aparentes entre réplicas ou entre concentrações observadas, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade. Ao pontuar, as placas foram distintas e contabilizáveis a olho nu, demonstrando a viabilidade da utilização de sobreposições líquidas, de forma a permitir um alto rendimento para RVFV.

Figure 1:RVFV comparações de sobreposições de placas utilizando 12 placas de poços. Os veros foram revestidos com 2,5 x 105 células em 12 placas de poços e infectados com 200 µl usando a mesma amostra inicial de MP12 diluída em série. Após a infecção foram aplicadas 1,5 ml de sobreposições de 0,3% de agarose,0,6% de Avicel, ou 1% de CMC (concentrações finais), a fim de comparar diretamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e tituladas no Painel B .

Figure 2:RVFV comparações de sobreposição de placas utilizando 6 placas de poços. Os veros foram revestidos com 5 x 105 células em 6 placas de poços e infectados com 400 µl usando a mesma amostra inicial de MP12 diluída em série. Foram aplicadas três sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% de Avicel, ou 1% de CMC, a fim de comparar diretamente as sobreposições como demonstrado nos Painéis A, B, e C. Experimentos separados foram realizados identicamente como descrito para os Painéis A-C, com placas contadas e tituladas no Painel D (N = 3).

Figure 3:VEEV placas de sobreposição utilizando 12 placas de poços. Os veros foram revestidos com 2,5 x 105 células em 12 placas de poços e infectados com 200 µl usando a mesma amostra inicial diluída em série da cepa da vacina VEEV TC-83. Após a infecção foram aplicadas 1,5 ml de sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% de Avicel, ou 1% de CMC, a fim de comparar diretamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e tituladas no Painel B.

Figure 4: Comparações de sobreposição de placas VEEV utilizando 6 placas de poços. Os veros foram revestidos com 5 x 105 células em 6 placas de poços e infectados com 400 µl usando a mesma amostra inicial de VEEV TC-83 diluída em série. Após a infecção, foram aplicadas sobreposições de 3 ml de agarose 0,3%, Avicel 0,6%, ou um CMC 1%, a fim de comparar diretamente as sobreposições como demonstrado nos Painéis A, B e C. Experimentos separados foram realizados identicamente como descrito para os Painéis A – C, com placas contadas e tituladas no Painel D (N = 3).

Figure 5:Influenza plaque overlay comparações. As células MDCK foram plaqueadas em 5 x 105 células em 6 placas de poços e infectadas com 400 µl de inóculo usando a mesma amostra inicial de Influenza B diluída em série de Taiwan. Não foi usado soro fetal bovino (FBS) nos meios de crescimento ou sobreposições, pois o FBS pode inibir a propagação do Influenza através da inibição de certas proteases que são necessárias para a fusão viral. A TPCK-trypsina foi adicionada a todas as sobreposições antes da aplicação, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada com as células hospedeiras. Após a infecção, 3 ml de sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% de Avicel, ou 1% de CMC foram aplicados para comparar diretamente as sobreposições como demonstrado nos painéis A, B e C. Experimentos separados foram realizados identicamente como descrito nos painéis A – C, com placas contadas e tituladas no painel D (N = 3). Enquanto uma média foi tomada para as placas CMC, elas se mostraram difíceis de contar de forma confiável, pois demonstraram bordas difusas e placas de tamanhos muito pequenos.

Figure 6:High throughput plaque overlays. Uma placa de 96 poços de Veros com 3 x 104 células por poço, foram infectados com 50 µl de inóculo usando a mesma amostra inicial serialmente diluída de RVFV MP12 durante 1 hr, em quadruplicado. Para as sobreposições, 0,6 e 1,2% de concentrações finais de Avicel foram triadas para determinar a viabilidade e reprodutibilidade da utilização de sobreposições líquidas de alta capacidade, os Painéis A e B.

Tabela 1:Condições de Inoculação da Placa e Tipos de Células

Tabela 2:Placa e Meios de Crescimento Virais/Celulares

Soluções de revestimento não expiram quando feitas enquanto a esterilidade for mantida.

Table 3:Overlays Stock

Quadro 4: Formatos de placas