3.1 OMVs: Composição, Biogénese e Funções
OMV são nanoestruturas lipídicas esféricas resistentes e discretas, com nanoestruturas esféricas de bílis, com diâmetros entre 10 e 300 nm, derivadas do envelope celular e incapazes de se replicarem independentemente (Kulp e Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4). O destacamento de OMVs foi observado pela primeira vez há mais de 50 anos em micrografias eletrônicas de transmissão retratando a ultraestrutura da parede celular bacteriana (Bladen e Waters, 1963; Bayer e Anderson, 1965; Chatterjee e Das, 1967). Foi estabelecido que estas estruturas nanosféricas compreendiam uma única membrana em torno de um centro denso de elétrons (Work et al., 1966). Outros estudos do mesmo período também relataram a presença de “glóbulos extracelulares” no sobrenadante livre de células de E. coli cultivado sob condições de crescimento limitantes de nutrientes (Bishop and Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Portanto, foi inicialmente postulado que a formação de OMVs ocorreu somente sob condições estressantes. No entanto, investigações posteriores demonstraram claramente que os OMVs também podiam ser detectados em condições não stressantes, tanto em ambientes laboratoriais como ambientais (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Actualmente, sabe-se que os OMV contribuem para uma miríade de funções biológicas chave, e um dos primeiros papéis alguma vez descritos para os OMV é o seu envolvimento na patogénese, particularmente como veículos de transmissão de factores de virulência (revisto em Ellis e Kuehn, 2010). Ao longo dos anos, funções adicionais foram atribuídas aos OMV, dependendo da espécie e das condições de cultivo, incluindo a comunicação intra-interespécie, a capacidade de resposta ao stress do envelope, a aquisição de nutrientes, a transferência horizontal de genes, actuando como agentes de “engodo”, bem como bens públicos (para uma descrição detalhada, ver Kulp e Kuehn, 2010 e Schwechheimer e Kuehn, 2015). Em geral, os OMV parecem promover a sobrevivência da bactéria dentro de um nicho ambiental específico, o que destaca a sua relevância para a homeostase bacteriana.
Fig. 4. Vesículas de membrana externa de bactérias Gram-negativas. (A) Representação de uma vesícula de membrana externa (painel OMV-upper) derivada do envelope da célula bacteriana (painel inferior). São mostrados detalhes da membrana externa (OM) e interna (IM), incluindo as proteínas transmembrana. O espaço periplásmico, no qual se encontra a camada de peptidoglicano (PG), mostra proteínas periplásmicas solúveis, proteínas desdobradas, e ácidos nucléicos. O conteúdo do OMV ilustra parte das biomoléculas que foram identificadas tanto na sua membrana como no lúmen. (B e C) Micrografias eletrônicas de transmissão de acetato de uranil com coloração negativa de Synechocystis sp. PCC 6803 liberando uma célula OMV (B, 120.000 × ampliação), e meio extracelular concentrado livre de células de Synechocystis sp. PCC 6803 mostrando vários OMVs (C, 40.000 × ampliação).
(A)Baseado em Jan, A.T., 2017. Vesículas de membrana externa (OMVs) de bactérias Gram-negativas: uma atualização em perspectiva. Frente. Microbiol. 8, 1053.
Muitos estudos mostraram que os OMVs são enriquecidos em componentes OM, nomeadamente LPS e OMPs, bem como proteínas periplasmáticas, fragmentos de PG, e mesmo ácidos citoplasmáticos e nucleicos (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). Relatos iniciais não diferenciavam os MVs artificialmente formados em solução (devido ao comportamento lipídico natural de se reagrupar em vesículas, material indiscriminadamente aprisionado da lise bacteriana) dos OMVs intactos. Mais recentemente, metodologias de isolamento melhoradas e técnicas ômicas de última geração permitiram uma análise cuidadosa da composição dos OMVs. Notavelmente, os OMV são de facto enriquecidos em componentes celulares específicos, ao mesmo tempo que são esgotados em outros (Lee et al., 2008), apoiando a ideia de que a selecção do conteúdo da carga não é um processo aleatório. Por exemplo, o conteúdo de OMVs de Salmonella sp. variou de acordo com as condições de crescimento testadas: em OMVs isolados de células sob condições nutricionais abundantes, proteínas citosólicas envolvidas na translação e metabolismo celular foram preferencialmente detectadas, enquanto sob condições nutricionais limitantes os OMVs foram enriquecidos em proteínas de membrana envolvidas no transporte de nutrientes (Bai et al., 2014). Além disso, uma abordagem baseada em espectrometria de massa indicou que nenhum componente específico amplamente conservado foi detectado em OMVs (Schwechheimer et al., 2013), mais uma vez apontando para uma composição variável. No total, espera-se que as composições diferenciais de OMVs estejam ambas relacionadas a particularidades do envelope celular dependente de tensão e nichos ecológicos distintos (Yoon, 2016).
Três mecanismos de formação de OMVs não-mutuamente exclusivos foram propostos. Em um modelo, a vesiculação ocorre quando as ligações cruzadas covalentes entre as proteínas da membrana e a camada PG são quebradas localmente, seja por uma diminuição temporária da abundância geral de ligações cruzadas ou por um deslocamento localizado de ligações cruzadas, promovendo o abaulamento de pequenas porções de OM. Outro modelo envolve nanoterritórios periplásmicos nos quais se acumulam proteínas desdobradas e outros componentes do envelope (fragmentos de LPS ou PG). Após este acúmulo anormal e confinado de componentes celulares, a integridade do envelope diminui localmente, desencadeando a bolha das porções de OM carregadas com conteúdo lumenal. Finalmente, também foi proposto que características biofísicas particulares de certos lipídios de OM podem promover a vesiculação, ao apontar a integração específica de LPS ou fosfolípidos, levando a alterações na fluidez e flexibilidade da membrana. Supõe-se também que muitos outros fatores afetam o tamanho, taxa de produção e composição dos OMVs, e se existe um processo de biogênese consensual dos OMVs, ele não é inteiramente caracterizado (Kulp e Kuehn, 2010; Schwechheimer e Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
Na pesquisa de cianobactérias, o campo dos OMVs é ainda bastante recente, e muito ainda está por ser explorado. Isto é particularmente bem ilustrado pelo fato de que a primeira publicação exclusivamente dedicada ao estudo de OMV cianobactérias data de 2014 (Biller et al., 2014). Neste estudo de ruptura de terreno, não só se mostra que as culturas controladas em laboratório da cianobactéria marinha Prochlorococcus libertam continuamente OMVs, mas também que estas vesículas podem ser encontradas em abundância em amostras de água do mar. Além disso, foi demonstrado que os OMVs de Prochlorococcus foram capazes de suportar o crescimento de culturas bacterianas heterotróficas, implicando estas estruturas em fluxos de carbono marinhos. Além disso, foram observadas interacções fagos-marinhos, mostrando o potencial dos OMV para agir como agentes de “engodo”. Globalmente, os autores ilustraram alguns dos papéis fundamentais dos OMV e suas inúmeras implicações para os ecossistemas microbianos (Biller et al., 2014). Numa publicação mais recente, os OMVs de Prochlorococcus foram comparados com os de outros três heterotrofos marinhos, numa tentativa de revelar a frequência de acondicionamento do DNA em vesículas e variação entre diferentes taxa (Biller et al., 2017). Ao examinar a quantidade e distribuição do DNA associado com OMVs, foi demonstrado que o DNA é diferentemente encapsulado dentro e entre as populações de OMVs. Mais decisivamente, este trabalho sugere que o mecanismo que embalou o DNA em OMVs não opera igualmente em todas as bactérias (Biller et al., 2017). Além do Prochlorococcus e das cepas de Synechococcus marinhas, outras cianobactérias também demonstraram formar e liberar OMVs, incluindo a unicelular Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) e Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), a filamentosa Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al, 2017), e a filamentosa, heterocitária Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) e Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Além dos papéis descritos acima para OMVs derivados de cianobactérias marinhas (Biller et al., 2014), outras funções foram propostas para estas vesículas extracelulares. A liberação de OMVs por cianobactérias poderia funcionar como uma rota de secreção eficaz. Uma estirpe de Synechococcus sp. PCC 7002, projetada metabometricamente, sem dois genes de glicogênio sintase, glgA-I e glgA-II, mostrou liberar significativamente mais OMVs do que a estirpe do tipo selvagem (Xu et al., 2013). Os autores supõem que, como esse mutante foi observado para exportar açúcares espontaneamente solúveis para o meio, os OMVs observados poderiam estar relacionados a esse mecanismo de secreção, embora o conteúdo de açúcar dos OMVs observados não tenha sido avaliado (Xu et al., 2013). Além disso, foi demonstrado que uma linhagem Synechocystis sp. PCC 6803 sem o homólogo TolC (essencial para mecanismos de secreção dependentes da membrana; ver Figs. 1 e 3) também liberou significativamente mais OMVs do que a linhagem parental (Oliveira et al., 2016). Como o tolC-knockout estava fortemente prejudicado na secreção de proteínas intracelulares, metabolitos e compostos exógenos, foi proposto que a hipervesiculação poderia preencher a necessidade de secreção. De comum acordo, os OMV cianobacterianos também foram sugeridos para transportar o material necessário para o desenvolvimento do biofilme. Isto foi proposto mediante observação de vesículas derivadas de cianobião no esporocarpo da samambaia Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Além disso, como foi observado material genético dentro dessas vesículas, elas poderiam ser vetores de transferência de genes laterais entre o cianobionte e a samambaia (Zheng et al., 2009). No entanto, os OMVs cianobacterianos também podem funcionar como um mecanismo para dissipar o estresse do envelope: Gonçalves et al. caracterizaram um conjunto de cepas Synechocystis sp. PCC 6803 sem vários componentes translocase IM envolvidos em sistemas de secreção dependentes de TolC (Gonçalves et al., 2018). Curiosamente, entre as várias estirpes que apresentaram diferentes capacidades de liberação de OMV, o tolC-knockout (o maior produtor de OMV do estudo) foi o único que apresentou níveis notavelmente altos de transcrição de espionagem e degQ, codificando proteínas envolvidas em respostas de estresse do envelope, e superexpressão de Spy e DegP (Gonçalves et al., 2018). Assim, os autores sugeriram que a deleção de tolC provoca estresse no envelope, e que a hiperversiculação no tolC-knockout representa um mecanismo independente para lidar com tais condições estressantes (Gonçalves et al., 2018).