Químicos e reagentes
GT foi adquirido no mercado em Taichung, Taiwan. IS (pureza 97%) foi obtido de Alfa Aesar (Lancaster, Reino Unido). 6,7-dimethoxycoumarin (6,7-DMC, pureza 98%) foi fornecido pela Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, E.U.A.). EC (pureza 90%), ECG (pureza 98%), EGCG (pureza 95%), ácido fórmico, probenecid, ácido fosfórico (glacial, 85%) e metilparabeno foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, E.U.A.). A EGC (pureza 92,7%) foi obtida da ChromaDex, Inc. (St. Louis, MO, EUA). (Irvine, CA, E.U.A.). e acetato de etilo foram de grau LC e obtidos da ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). O acetonitrilo era de grau LC/MS e foi comprado da Millinckrodt Baker, Inc. (Miaoli Hsien, Taiwan). (Phillipsburg, NJ, E.U.A.). O soro fetal bovino foi obtido da Biological Industries Inc. (Biological Industries Inc.). (Kibbutz, Beit Haemek, Israel). Penicilina-estreptomicina-glutamina, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, trypsin/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution e 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, E.U.A.). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 foi obtido da Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). A 6-Carboxifluoresceína foi comprada da AAT Bioquest Inc. (AAT Bioquest Inc.). (Sunnyvale, CA, EUA) e 5-carboxifluoresceína foi obtida da Acros Organics (Geel, Bélgica). Milli-Q mais água (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) foi utilizada para todas as preparações.
Preparação e caracterização da infusão de GT
A infusão foi produzida através da imersão de 2 ou 4 g de GT em 50 mL de água desionizada quente (98-100 °C) durante 30 min. A infusão foi filtrada com gaze enquanto quente para permitir concentrações de 40 e 80 mg/mL, respectivamente, que foi recentemente administrada a ratos via gavagem gástrica.
Para a caracterização da infusão de GT, após filtração da infusão de GT com 0,2 μm filtro RC15 (Sartorious, Goettingen Alemanha), 100 μL do filtrado foi misturado com 900 μL de metanol e centrifugado para remover o precipitado. A infusão devidamente diluída (50 μL) foi combinada com 50 μL de solução 6,7-DMC (2,0 μg/mL em metanol) como padrão interno e 5 μL foi submetida a análise LC-MS/MS. O sistema HPLC incluiu a bomba Accela 1250 e o amostrador automático (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna analítica Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) com um pré-filtro. A fase móvel consistiu de acetonitrilo contendo 0,01% de ácido fórmico (A) e água contendo 0,01% de ácido fórmico (B) e programada de forma gradiente como se segue: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) e 2/98 (12 min). A vazão foi de 0,2 mL/min. O efluente da coluna foi detectado pela sonda H-ESI (heated-electrospray ionization) -II com espectrômetro de massa Quantum Access MAX quadrupole triplo estágio (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). O nitrogênio foi utilizado como gás de bainha em 35 unidades arbitrárias e o gás auxiliar em 10 unidades arbitrárias. A energia de colisão foi fixada em -19/18 V, a tensão de pulverização em -3000/3000 V, a temperatura capilar em 350 °C, a temperatura do vaporizador em 350 °C e o deslocamento da lente do tubo em -80/88 V. As seguintes transições de massa foram utilizadas para a análise de monitoramento de reação selecionada (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) e 6,7-DMC (207/151). Os espectros ESI-MS foram registrados em modo íon negativo para EC, EGC, ECG e EGCG e em modo íon positivo para 6,7-DMC.
Animais
Ratos Sprague-Dawley machos (270-360 g) foram adquiridos no National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) e alojados em ambiente condicionado com ciclos de luz/obscuridade de 12 horas. Alimentos e água foram adquiridos ad libitum até 12 h antes dos experimentos. Os ratos foram divididos em dois grupos. O primeiro experimento usou 28 ratos para determinar o efeito do GT sobre os níveis séricos de EI e PCS em ratos CRF; o segundo experimento usou 14 ratos para avaliar o efeito do GT sobre a função renal de ratos CRF. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do “The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” publicado pela Sociedade Chinesa de Ciência Animal, Taiwan, R.O.C. O protocolo experimental foi revisto e aprovado em 08/01/2014 (Número de licença: 103-126-N) pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da China, Taiwan, R.O.C.
Estabelecimento do modelo CRF e administração de infusão de GT
CRF foi induzido via administração oral de adenina após estudos anteriores, mas com algumas modificações19,23,35,36. Em resumo, a adenina suspensa em metilcelulose 400 a 0,5% (15 mg/mL) foi administrada oralmente a 28 ratos via gavagem gástrica duas vezes ao dia, durante sete doses consecutivas (15 mg/rato), durante todo o período experimental. No quarto dia, foram determinados os níveis séricos de EI. Ao confirmar a função renal atenuada pela elevação significativa dos níveis séricos de EI, os ratos CRF foram divididos em três grupos (8-10 ratos em cada grupo) com níveis de EI comparáveis. O primeiro grupo recebeu 400 mg/5 mL/kg de infusão de GT duas vezes ao dia para sete doses consecutivas; o segundo grupo recebeu 200 mg/5 mL/kg de GT duas vezes ao dia para sete doses consecutivas; e o terceiro grupo recebeu 5 mL/kg de água em paralelo como controle. No oitavo dia, foi administrada aos ratos a 7ª dose de GT às 9:00 horas após o jejum da noite e as amostras de sangue foram coletadas aos 0, 15, 30, 60, 120, 180 e 360 minutos após a dosagem. O tempo programado para a coleta de sangue e a administração de adenina e GT estão resumidos na Fig. 3. Em cada colheita, 0,5 ml de sangue foram retirados sob anestesia isoflurana. As amostras de sangue foram coletadas em microtubos e centrifugadas a 10.000 g durante 15 min para obtenção de soro, que foi armazenado a -20 °C antes da análise.
Determinação das concentrações de SI e PCS no soro
Para a determinação das concentrações de SI e PCS no soro, 50 μL da amostra de soro foi vortexada com 200 μL de metanol contendo 10 μg/mL de 6,7-DMC ou 100 μg/mL de metilparabeno como padrões internos, respectivamente, e centrifugada para remover o precipitado, então uma alíquota de 20 μL foi submetida à análise por HPLC.
Para as preparações de calibrador, 50 μL de soro foi perfurado com uma série de concentrações de SI e PCS para permitir faixas de concentração de 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) e 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM), respectivamente. O último procedimento seguido foi o descrito acima para as amostras de soro. As curvas de calibração foram desenhadas por regressão linear das relações de área de pico (IS ou PCS para padrão interno) contra as concentrações conhecidas de IS e PCS, respectivamente.
O aparelho HPLC incluiu uma bomba (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japão), detector de fluorescência (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japão) e injector automático (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japão). A coluna Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, EUA) foi equipada com uma coluna de guarda (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tóquio, Japão). A fase móvel consistiu de acetonitrilo (A)-0,1% ácido fosfórico (B) e programada de forma gradiente, como se segue: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) e 15/85 (24-35 min) para IS e 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) e 16/84 (24-36 min) para PCS. Os ajustes dos detectores foram Ex 280 nm/Em 375 nm para IS e Ex 214 nm/Em 306 nm para PCS. As taxas de fluxo foram 1,0 mL/min.
Efeito do GT em Cr e BUN em ratos CRF
Em outro experimento, o mesmo protocolo animal mencionado acima foi empregado e as concentrações de Cr e BUN foram determinadas antes do tratamento com adenina (Dia 0), antes da dosagem de GT (Dia 4) e após a 7ª dose de GT (Dia 8). Ao confirmar a função renal atenuada por elevação significativa de Cr e BUN no dia 4, os ratos CRF foram divididos em dois grupos (7 ratos por grupo) com níveis de Cr comparáveis. O primeiro grupo recebeu 400 mg/5 mL/kg de GT duas vezes ao dia durante sete doses consecutivas; o segundo grupo recebeu 5 mL/kg de água em paralelo como controle. No oitavo dia, foi administrada a 7ª dose de GT e água aos ratos após um jejum noturno e as amostras de sangue foram coletadas 30 minutos depois. Cr foi determinado por um método de picrato alcalino cinético num ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). O BUN foi testado pela reação urease/glutamato desidrogenase para-enzima usando o mesmo analisador.
Linha celular e condições de cultura
Construção das linhas celulares transfectadas estavelmente utilizadas para estudos de transporte, células de ovário de hamster chinês (CHO) expressando hOAT1 (CHO-hOAT1), células de rim embrionário humano 293 (HEK) expressando hOAT3 (HEK-hOAT3) e suas correspondentes linhas celulares de controle vazias transferidas por vetor, foi descrito anteriormente40,41. As células CHO foram mantidas a 37 °C com 5% de CO2 em meio DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) contendo 10% de soro, 1% de penicilina/streptomicina e 1 mg/mL de G418. As células HEK foram mantidas a 37 °C com 5% de CO2 em meio DMEM de alta glicose (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) contendo 10% de soro, 1% de penicilina/streptomicina e 1 mg/mL de G418, USA) contendo 10% de soro, 1% de penicilina/streptomicina e 50 μg/mL de higromicina B. As células foram cultivadas em pratos revestidos com Poly-D-Lysine.
Preparação e caracterização dos metabolitos séricos de GT (GTM)
A fim de imitar as moléculas interagindo com OATs in vivo, GTM foram preparados a partir de ratos e caracterizados. Em resumo, a infusão de GT (800 mg/10 mL/kg) foi administrada oralmente a ratos em jejum durante a noite. O sangue foi coletado aos 15 minutos após a dosagem da infusão de GT. Após a coagulação, o soro foi coletado e vortexado com metanol a 3 vezes. Após centrifugação a 10.000 g por 15 min, o sobrenadante foi concentrado em um evaporador rotatório sob vácuo para secar. Um volume adequado de água foi adicionado ao resíduo, produzindo uma solução com 10 vezes a concentração sérica, que foi dividida em alíquotas e armazenada a -80°C para uso posterior.
Uma porção de GTM foi caracterizada seguindo um método anterior com algumas modificações16,46. Em resumo, 100 μL de amostra de soro foi misturado com 50 μL de sulfatase (contendo 1000 unidades/mL de sulfatase e 39.861 unidades/ml de ß-glucuronidase), 50 μL de ácido ascórbico (200 mg/mL) e incubado a 37 °C durante 45 min sob condição anaeróbica. Após a hidrólise, o soro foi adicionado a 50 μL 0,1 N HCl e depois dividido com 250 μL de acetato de etilo (contendo 100 ng/mL de 6,7-DMC como padrão interno). A camada de acetato de etilo foi evaporada sob N2 até secar e reconstituída com um volume apropriado de fase móvel antes da análise LC-MS/MS. A fase móvel consistiu de acetonitrilo (A) – água contendo 0,1% de ácido fórmico (B) e programada de forma gradiente, como se segue: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) e 2/98 (12 min). A vazão foi de 0,2 mL/min.
Efeitos do GTM no transporte de captação mediado por hOAT1 e hOAT3
CélulasCHO-hOAT1 e HEK-hOAT3 (1 × 105 células/poço) foram cultivadas em uma placa de 96 poços. 6-Carboxifluoresceína (6-CF) e 5-carboxifluoresceína (5-CF) foram utilizadas como sondas para avaliar o efeito do GTM na atividade do hOAT1 e do hOAT3, respectivamente47,48. Além disso, como controle positivo para inibição de hOAT1 e hOAT349 foi utilizado o probenecid (80 μM). Após 24 h ou 48 h de incubação de CHO-hOAT1 ou HEK-hOAT3, o meio foi removido e lavado três vezes com tampão PBS. Antes do experimento de transporte, as células CHO-hOAT1 e HEK-hOAT3 foram pré-incubadas com agentes de teste (GTM e probenecid) a 37 °C. Após 30 min de incubação, foram adicionados 6-CF ou 5-CF e incubados por mais 5 min e 10 min, respectivamente. As placas foram imediatamente colocadas em banho de gelo e os sobrenadantes foram removidos e as células foram lavadas três vezes com PBS gelada. Posteriormente, 100 μL de 0,1% de Triton X-100 foi adicionado às células e a fluorescência foi medida com excitação a 485 nm e emissão a 528 nm. Para quantificar o conteúdo de proteína em cada poço, 10 μL de lisado celular foi adicionado a 200 μL de reagente de ensaio de proteína diluída (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e a densidade óptica foi medida a 570 nm. O acúmulo intracelular relativo de 6-CF ou 5-CF foi calculado por comparação com o dos controles após a correção da proteína.
Análise de dados
O pico de concentração sérica (Cmax) foi obtido a partir da observação experimental. A área sob a curva concentração sérica – tempo (AUC0-t) foi calculada utilizando a regra trapezoidal até o último ponto. As diferenças de EI e PCS entre três grupos foram analisadas através da ANOVA unidirecional, enquanto a diferença de Cr e BUN entre dois grupos foi analisada através do teste t de Student não pareado, tomando p < 0,05 como nível significativo. O teste t de Student não-parado também foi utilizado para a análise de ensaios in vitro.