Um procedimento geral de blotting começa com a extração do RNA total de uma amostra de tecido homogeneizado ou de células. O mRNA eucariótico pode então ser isolado através do uso de cromatografia de celulose de oligo (dT) para isolar apenas aqueles RNAs com cauda de poli(A). As amostras de RNA são então separadas por eletroforese em gel. Como os géis são frágeis e as sondas não conseguem entrar na matriz, as amostras de RNA, agora separadas por tamanho, são transferidas para uma membrana de nylon através de um sistema de capilaridade ou blotting a vácuo.
Configuração do sistema de blotting capilar para a transferência do RNA de um gel de eletroforese para uma membrana blotting.
Uma membrana de nylon com carga positiva é a mais efetiva para uso no blotting norte, uma vez que os ácidos nucléicos carregados negativamente têm uma alta afinidade para eles. O buffer de transferência usado para o blotting geralmente contém formamide porque baixa a temperatura de recozimento da interação sonda-RNA, eliminando assim a necessidade de altas temperaturas, o que poderia causar degradação do RNA. Uma vez que o RNA tenha sido transferido para a membrana, ele é imobilizado através da ligação covalente à membrana pela luz UV ou calor. Depois de uma sonda ter sido rotulada, ela é hibridizada com o RNA na membrana. As condições experimentais que podem afetar a eficiência e especificidade da hibridação incluem força iônica, viscosidade, comprimento duplex, pares de bases desencontrados e composição da base. A membrana é lavada para assegurar que a sonda foi ligada especificamente e para prevenir o surgimento de sinais de fundo. Os sinais híbridos são então detectados por película de raios X e podem ser quantificados por densitometria. Para criar controles para comparação em um blot do norte, amostras não exibindo o produto genético de interesse podem ser usadas após a determinação por microarrays ou RT-PCR.
GelsEdit
RNA rodar em um gel de agarose de formaldeído para destacar as subunidades ribossomal 28S (banda superior) e 18S (banda inferior).
As amostras de RNA são mais comumente separadas em géis de agarose contendo formaldeído como agente desnaturante para que o RNA limite a estrutura secundária. Os géis podem ser corados com brometo de etídio (EtBr) e visualizados sob luz UV para observar a qualidade e quantidade de RNA antes da blotting. A eletroforese em gel de poliacrilamida com uréia também pode ser usada na separação do RNA, mas é mais comumente usada para RNA fragmentado ou microRNAs. Uma escada de RNA é frequentemente executada ao lado das amostras em um gel de eletroforese para observar o tamanho dos fragmentos obtidos, mas no total de amostras de RNA as subunidades ribossômicas podem atuar como marcadores de tamanho. Como a subunidade grande do ribossomo é 28S (aproximadamente 5kb) e a subunidade pequena do ribossomo é 18S (aproximadamente 2kb), duas bandas proeminentes aparecem no gel, a maior com cerca do dobro da intensidade da menor.
ProbesEdit
Probes para o blotting norte são compostos de ácidos nucleicos com uma seqüência complementar a todo ou parte do RNA de interesse, eles podem ser DNA, RNA, ou oligonucleotídeos com um mínimo de 25 bases complementares à seqüência alvo. As sondas de RNA (riboprobes) que são transcritas in vitro são capazes de suportar etapas de lavagem mais rigorosas evitando algum do ruído de fundo. Normalmente o cDNA é criado com primers rotulados para que a sequência de RNA de interesse actue como a sonda na mancha norte. As sondas devem ser rotuladas com isótopos radioativos (32P) ou com quimioluminescência na qual a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano (HRP) quebra os substratos quimioluminescentes produzindo uma emissão detectável de luz. A marcação quimioluminescente pode ocorrer de duas formas: ou a sonda está ligada à enzima, ou a sonda está marcada com um ligando (por exemplo, biotina) para o qual o ligando (por exemplo, avidina ou estreptavidina) está ligado à enzima (por exemplo, HRP). A película de raios X pode detectar tanto os sinais radioactivos como os quimioluminescentes e muitos investigadores preferem os sinais quimioluminescentes porque são mais rápidos, mais sensíveis e reduzem os riscos para a saúde que acompanham as etiquetas radioactivas. A mesma membrana pode ser sondada até cinco vezes sem uma perda significativa do RNA alvo.