Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) decocção é uma fórmula da medicina tradicional chinesa. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito do XYS sobre as habilidades cognitivas e seu mecanismo subjacente em ratos ovariectomizados. Ratos Sprague-Dawley fêmeas foram ovariectomizadas e tratadas com XYS (3 g/kg ou 9 g/kg) por gavagem, com injeção subcutânea de 17-β estradiol (E2, 2 μg/kg) como controle positivo de drogas e gavagem de 1 ml de soro fisiológico (0,9%) como controle placebo. Após 6 semanas de tratamento, os ratos foram examinados usando o teste do labirinto de água Morris. O nível de estradiol no soro e hipocampo foi medido por ELISA. A coloração de Golgi foi realizada para observar a morfologia neuronal no hipocampo. Apoptose de células hipocampais foi observada pela coloração TUNEL. O conteúdo proteico do receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) 2A e 2B na região hipocampal CA1 foi determinado por Western blot e imunohistochemistry. A expressão do receptor de estrogênio (ER) e a sinalização PI3K foi detectada pelo Western blot. Comparado com o grupo sham, tanto a aprendizagem quanto a memória foram prejudicadas em ratos ovariectomizados. Ratos tratados com E2 ou XYS de alta dose mostraram melhor aprendizagem e memória em comparação com os ratos tratados com soro fisiológico. As altas doses de XYS reduziram significativamente a latência de escape no ensaio de aquisição espacial; enquanto isso, os tempos cruzados e a duração no quadrante da sonda foram aumentados no ensaio da sonda espacial. A XYS de alta dose promoveu a síntese de novo conteúdo de E2 no hipocampo, mas não teve efeito significativo sobre o nível sérico de E2. A coloração de Golgi indicou que a XYS de alta dose poderia aumentar o número de ramos e a densidade das espinhas dendríticas na região hipocampal CA1. A coloração TUNEL mostrou que a alta dose de XYS aliviou a apoptose neuronal induzida por ovariectomia. O nível de expressão de NMDAR2A e NMDAR2B na região hipocampal CA1 foi upregado pelo tratamento com XYS. O efeito benéfico do XYS foi através da activação da sinalização ERα-PI3K. Em conclusão, o tratamento XYS em altas doses pode melhorar as habilidades cognitivas de ratos ovariectomizados protegendo os neurônios hipocampais e restaurando o nível hipocampais E2.
1. Introdução
As mulheres perimenopausadas freqüentemente sofrem de ansiedade e depressão relacionadas com a flutuação do nível de estrogênio. Além da ansiedade e da depressão, o esquecimento é outra queixa comum em mulheres perimenopausais. O Seattle Midlife Women’s Health Study relatou que 60% das mulheres de meia-idade notaram deterioração da memória . O Estudo de Saúde da Mulher em Toda a Nação (SWAN) descobriu que a perimenopausa era um fator de risco dependente para o esquecimento auto-referido em mulheres de meia-idade. Como o cérebro é um importante alvo de regulação do estrogênio, especula-se que a deficiência de estrogênio pode ser responsável pela deficiência cognitiva. Entretanto, os resultados de estudos observacionais sobre a influência na cognição não são totalmente consistentes. Além disso, ainda não foram estabelecidas intervenções hormonais terapêuticas eficazes para melhorar o desempenho cognitivo. Além disso, outros factores, como a percepção de stress, humor e saúde física, podem também contribuir para os sintomas da memória . A produção de estrogénio no ovário é mais susceptível de afectar a memória em caso de diminuição abrupta do que em caso de transição natural . Ao contrário da inconsistência em estudos humanos, os achados em animais ovariectomizados suportam a associação da deficiência de estrogênio com alterações cognitivas e eficiência da terapia de reposição hormonal .
A suplementação com fitoestrogênios é uma terapia alternativa popular para aliviar os sintomas da menopausa. Os fitoestrogenios, como os flavonóides, isoflavonas e lignanos, têm estrutura semelhante aos estrogénios esteróides e podem desempenhar um papel semelhante ao dos estrogénios, activando os receptores de estrogénio (ER). Uma meta-análise apoiou a eficiência da suplementação de isoflavonas de soja na melhoria da memória visual em mulheres saudáveis na pós-menopausa. O estudo SWAN Phytoestrogen Ancillary Study mostrou que a ingestão elevada de isoflavona ou lignina poderia melhorar a velocidade de processamento ou a memória verbal em um determinado estágio da menopausa, embora o benefício também estivesse relacionado à etnicidade/raça . O efeito dos fitoestrogênios na melhoria da cognição é mais obviamente indicado em estudos com animais. Um extrato hidroalcoólico de sementes de feno-grego poderia atenuar a ovariectomia – (OVX-) induziu danos aos neurônios hipocampais e melhorar a aprendizagem e o desempenho da memória em um modelo de rato .
Xiao-Yao-San (XYS), que significa pó feliz e despreocupado em chinês, é uma fórmula da medicina tradicional chinesa (MTC) que é usada para tratar a ansiedade e depressão na menopausa. A fórmula consiste em Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe), e Glycyrrhizae radix (Gancao). Uma análise sistemática incluindo 26 ensaios randomizados mostrou que o XYS era superior aos antidepressivos, indicados pela escala de depressão Hamilton, e poderia aumentar a eficácia dos antidepressivos na melhoria da auto-avaliação da escala de depressão. Mulheres perimenopausais com exoftalmia e palpitação também poderiam se beneficiar do tratamento com XYS . Algumas ações terapêuticas da XYS no alívio da síndrome menopausal podem ser atribuídas à presença de fitoestrogênios. Vários estudos relataram a presença de fitoestrogênios na XYS. Ergosterol é encontrado em Poria cocos (Fuling) , e β-sitosterol é conhecido por estar presente em Angelicae radix (Danggui) . Miller-Marini et al. desenvolveram um ensaio de receptor estrogênio-quimérico/elemento de resposta regulado/luciferas-reporter para detectar a presença de fitoestrogênios em fórmulas complexas de MTC. Eles analisaram Bupleurum & Peony Formula, uma fórmula modificada de XYS com as mesmas ervas principais e encontraram conteúdo mensurável de fitoestrogênio .
A presença de fitoestrogênios em XYS sugere que XYS tem o potencial de tratar o comprometimento cognitivo causado pela deficiência de estrogênio. Um estudo animal mostrou que XYS poderia atenuar o stress de imobilização crônica (CIS) induzido pela aprendizagem e déficit de memória . Atualmente, nenhum estudo avaliou o efeito do XYS na melhoria do comprometimento cognitivo em mulheres perimenopausadas. Portanto, o presente estudo investigou o efeito da XYS nas capacidades cognitivas e o seu mecanismo subjacente em ratos OVX.
2. Materiais e Métodos
2.1. Animais e Tratamento
No total, 60 ratos Sprague-Dawley fêmeas foram utilizados neste estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional de Animais Experimentais (número de aprovação: ACU170802). Os animais foram alojados com livre acesso à água e à dieta padrão sob condições controladas de temperatura e umidade. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (12 ratos/grupo): grupo sham, grupo OVX + salino ou O-salino, grupo OVX + 17-β estradiol (E2) ou grupo O-E2, grupo OVX + XYS 9 g/kg ou grupo O-XYS9 e grupo OVX + XYS 3 g/kg ou grupo O-XYS3. Os ratos foram submetidos à operação OVX sob anestesia, conforme descrito anteriormente. Em resumo, foi feita uma incisão longitudinal em um terço do tronco e a 1-2 cm de distância de cada lado da coluna vertebral. O tecido adiposo foi suavemente puxado para fora com uma pinça. O ovário foi identificado, e os chifres uterinos foram ligados. O ovário foi removido, e a incisão abdominal foi suturada. No grupo da farsa, o abdômen foi incisado sem OVX.
O tratamento foi iniciado duas semanas após a operação de OVX e durou seis semanas. Os ratos do grupo de tratamento XYS receberam XYS com uma única dose diária de 9 g/kg ou 3 g/kg. A injeção subcutânea de E2 (2 μg/kg) foi definida como um controle de drogas positivo. A gavagem de 1 ml de soro fisiológico (0,9%) foi definida como um controle placebo. A decocção XYS foi utilizada na forma de um extrato (1 g/ml, equivalente a 1 g de ervas brutas/ml), que foi fornecido pelo Hospital Afiliado da Universidade de Nanjing de Medicina Tradicional Chinesa. A fórmula de decocção do XYS foi relatada preciosamente . A dose de XYS utilizada na clínica para mulheres perimenopausadas é de 175 g de ervas brutas/60 kg, o que equivale a 3,5 g/kg em ratos. Referindo-se a outros relatórios experimentais sobre o modelo de rato, fixamos a dose baixa em 3 g/kg e a dose alta em 9 g/kg . O E2 em pó (Cat. nº E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) foi dissolvido em uma pequena quantidade de etanol, e então 20 μg/ml de solução de meia foi preparada com 0,9% de solução salina.
2,2. Morris Water Maze Test
A função de aprendizagem e memória de ratos foi avaliada usando o teste Morris water maze (MWM) . O dispositivo experimental MWM é uma piscina redonda (200 cm de diâmetro) com 38-40 cm de altura de água. A temperatura da água é mantida constante a 20-22°C. O teste WMW consiste em três partes, nomeadamente, o ensaio de aquisição espacial (com duração de 5 dias), o ensaio de sonda espacial, e o ensaio de plataforma visível. No ensaio de aquisição espacial, os ratos foram suavemente colocados num quadrante aleatório do tanque de água com a plataforma escondida 1,5 cm no quadrante nordeste abaixo da água. Cada rato foi autorizado a nadar por até 60 s para encontrar a plataforma. Os ratos que não conseguiram encontrar a plataforma dentro de 60 s foram guiados até ela e a latência foi registrada como 60 s. A latência de fuga foi registrada por um sistema de análise de vídeo (QUALQUER sistema de análise de comportamento animal, Stoelting Company, EUA). Os ratos foram treinados 4 vezes por dia. Após 5 dias de treinamento, os ratos receberam o teste da sonda espacial com a plataforma removida do quadrante nordeste. Os ratos foram colocados no mesmo local inicial, no quadrante noroeste. Os vestígios de viagem dos ratos em busca da plataforma em 120 s foram registrados. A duração e os tempos de cruzamento no quadrante alvo foram calculados para avaliar a retenção da memória espacial. No dia seguinte após o ensaio da sonda espacial, os ratos receberam o ensaio da plataforma visível semelhante ao treino da plataforma oculta, em que a plataforma foi elevada 1,5 cm acima da superfície da água e colocada no quadrante sudoeste. Cada rato foi libertado 4 vezes, e cada vez a partir de um ponto de entrada diferente. A latência de fuga, distância de natação e velocidade de natação foram registradas.
2.3. Coleta de amostras
Após o término do teste MWM, os ratos foram toracotomizados e intubados na aorta ascendente via ventrículo esquerdo sob anestesia com pentobarbital de sódio (40 mg/kg via injeção intraperitoneal). O sangue do tronco foi coletado com tubo separador de soro para detecção de E2. Hipocampos de seis ratos foram separados do córtex cerebral e tecidos cerebrais circunvizinhos, rapidamente removidos, lavados com PBS fria e congelados em nitrogênio líquido para detecção de E2 e Western blot. Três tecidos cerebrais não fertilizados foram imobilizados em paraformaldeído a 4% durante 24 h e usados para coloração de Golgi e imunohistoquímica. Os três ratos esquerdos foram perfundidos transardialmente com soro fisiológico frio, seguidos por fixação de paraformaldeído a 4% por 1 h. O cérebro foi então removido, fixado em paraformaldeído a 4% por 24 h, e embutido em parafina para coloração TUNEL.
2,4. E2 Detection
Amostras de sangue foram permitidas a coagular à temperatura ambiente e foram centrifugadas por 15 min a 4°C para separar o soro. Os tecidos do hipocampo foram pesados, homogeneizados em soro fisiológico frio e centrifugados a 20 min para coletar o sobrenadante. O conteúdo de E2 no soro e no sobrenadante homogenizado do hipocampo foi detectado pelo kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).
2.5. Golgi Staining
O hipocampo foi cortado em pequenos blocos e processado para coloração Golgi como descrito . Em resumo, os blocos de hipocampo foram imersos na solução de coloração Golgi (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China) por 14 dias, durante os quais a solução de coloração foi substituída a cada 2-3 dias. Os tecidos foram desidratados com 30% de sacarose e seccionados em 100 μm. As seções foram processadas com desidratação de etanol, clarificadas com xileno e montadas em lâminas revestidas com gelatina. A coloração de Golgi foi realizada com sucesso em todas as amostras. A morfologia dos neurônios do hipocampo foi observada sob microscópio de luz (Nikon, Tóquio, Japão). Os neurônios na região CA1 do hipocampo foram analisados usando o Neurônio J plugado no software Image J. Cinco seções foram selecionadas para cada rato, e espinhas dendríticas com morfologia completa foram selecionadas para cada seção . A densidade e pontos de ramos das espinhas dendríticas foram medidas.
2.6. Imunohistoquímica
Expressão de N-metil-D-aspartate receptor (NMDAR) subunidades 2A e 2B no hipocampo foi determinada por imunohistoquímica de acordo com o procedimento padrão . Os anticorpos primários utilizados foram o coelho anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) e o coelho anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China). O anticorpo secundário foi o anticorpo conjugado com HRP IgG (Servicebio).
2.7. TUNEL Staining
As alterações morfológicas no hipocampo foram detectadas pela coloração TUNEL com um kit comercial (Roche, Mannheim, Alemanha) como instruído. Os cortes foram submetidos à reação colorimétrica DAB seguida pela coloração com hematoxilina. O núcleo das células apoptóticas positivas da TUNEL era marrom sob microscópio claro. Cinco secções foram seleccionadas para cada rato e três campos não repetitivos (ampliação de 400x) foram seleccionados para cada secção. A porcentagem de células TUNEL-positivas em todas as células foi calculada.
2,8. Western Blot
A parte do cérebro hipocampal CA1 foi rapidamente extraída e cortada em pequenas secções de acordo com o Atlas do cérebro. Os tecidos do hipocampo foram incubados durante a noite com tampão de lise RIPA (contendo 100 Mm de PMSF, adquirido da Servicebio). Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação durante 10 min. para recolher o sobrenadante contendo proteína. A concentração de proteína foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). Os lisados de proteína (30 μg/lane) foram separados por 10% de SDS-PAGE e eletroblotados na membrana PVDF. Depois de ser bloqueada com 5% de leite sem gordura, a membrana foi sondada durante a noite com os seguintes anticorpos primários: coelho anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), coelho anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), coelho anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), coelho anti-ERα (1 : 2000, Millipore), coelho anti-phospho-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), coelho anti-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), coelho anti-Bax (1 : 1000, Abcam), coelho anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam), e coelho anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). O GAPDH foi detectado como controle interno. Depois a membrana foi sondada com peroxidase de rábano secundário (HRP-) conjugado com IgG (1 : 5000, Bioworld) de cabra anti-coelho durante 1,5 h. As bandas foram visualizadas pelo método de quimioluminescência. A densidade óptica média das bandas de proteínas foi quantificada pelo software Image J.
2.9. Análise estatística
Os dados experimentais foram analisados pelo software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, EUA). Os dados numéricos foram expressos como média ± SD. A diferença entre dois grupos foi comparada pelo teste t. Os resultados do teste em plataforma oculta foram analisados por grupo × dia repetido – medidas ANOVA seguidas pelo pós-teste de Tukey. Outras comparações múltiplas foram analisadas pela ANOVA unidirecional seguida pelo valor pós-hoc. de Tukey < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
3. Resultados
3,1. Xiao-Yao-San Decoction Improves Spatial Learning and Memory Abilities of Ovariectomized Rats
A capacidade de aprendizagem foi primeiramente avaliada usando o experimento de aquisição espacial. As medidas repetidas da ANOVA mostraram que tanto os dias de tratamento quanto os de treinamento afetaram a latência de escape (Figura 1(a)). A latência de escape em todos os grupos diminuiu com o aumento dos dias de treinamento (), e a diferença também foi significativa na tendência de declínio da latência dentro de cada grupo (). Não houve interação entre os dias de tratamento e os dias de treinamento (). Durante os dois primeiros dias de treinamento, não foi observada diferença significativa na latência de fuga de cada grupo. A partir do terceiro dia de treinamento, a latência de escape foi significativamente maior do que a do grupo sham; a latência de escape do grupo E2 e XYS9 de alta dose foi menor do que a do grupo salino, mas não diferente da latência do grupo sham. Após 5 dias de treinamento, os ratos foram avaliados com o teste da sonda para testar a memória espacial. Como mostrado na Figura 1(b), os tempos cruzados, tempo de duração e porcentagem de tempo de duração no quadrante da sonda foram significativamente reduzidos no grupo salino. Não foi observada diferença no tempo de duração em outros quadrantes. O tratamento com XYS ou E2 poderia restaurar significativamente os tempos cruzados e o tempo de duração no quadrante das sondas para o nível do grupo de sham. A fim de excluir os efeitos de fatores ambientais e níveis cognitivos e de atividade de animais experimentais na aprendizagem espacial e na memória, os ratos também foram submetidos ao estudo em plataforma visível (Figura 1(c)). Não houve diferença significativa na latência de fuga, distância de natação e velocidade de natação entre os grupos. Em conjunto, esses resultados sugerem que a aprendizagem espacial e a memória foram prejudicadas em ratos OVX, e o tratamento com doses elevadas de XYS poderia efetivamente melhorar as funções cognitivas prejudicadas.
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3.2. Xiao-Yao-San Decocção Aumenta o Teor de Estrogênio Hipocampal em Ratos Ovariectomizados
Próximo, estudamos o efeito do XYS no nível de estrogênio em ratos OVX. Como mostrado na Figura 2(a), o tratamento com XYS não melhorou o nível sérico de estradiol reduzido devido ao OVX; entretanto, não houve diferença significativa nos níveis séricos de estradiol entre os grupos de tratamento com xampu e OVX. De notar que a XYS em doses elevadas e o E2 aumentaram o nível de estradiol hipocampal em comparação com a solução salina (Figura 2(b)). O grupo O-XYS3 ainda tinha níveis mais baixos de estradiol hipocampal do que o grupo da sham. A alteração do conteúdo de E2 hipocampal pode não ser explicada pela alteração do conteúdo de E2 derivado de gônadas, mas sim pela alteração da síntese in situ. Portanto, detectamos a expressão de CYP19, a enzima final na síntese de estrogênio, no hipocampo. Os resultados mostraram que o tratamento com XYS ou E2 poderia aumentar a expressão do CYP19 em comparação com o grupo salino (), mas apenas a diferença entre as doses altas de XYS e os grupos salinos foi significativa (). O tratamento não restabeleceu o nível de CYP19 ao do grupo da farsa. Os resultados sugerem que a XYS promoveu a expressão da aromatase no hipocampo, aumentando assim a síntese de novo de E2.
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3.3. Xiao-Yao-San Decocção Reduz Danos Neuronais no Hipocampo de Ratos Ovariectomizados
Morfologia celular no hipocampo, especialmente na região CA1, tem um papel importante na capacidade cognitiva. A morfologia celular do hipocampo foi analisada pela coloração de Golgi, como mostra a Figura 3(a). Comparado com o grupo de sham, o número de neurônios no grupo salino diminuiu significativamente, e a morfologia das espinhas dendríticas foi danificada. Uma análise adicional dos neurônios CA1 mostrou que o número de neurônios e a densidade da coluna dendrítica diminuíram significativamente no grupo salino (Figuras 3(b) e 3(c)). A alta dose de tratamento XYS aumentou o número de neurônios no hipocampo e elevou o número pontual de neurônios e a densidade da coluna vertebral na região CA1. O tratamento E2 teve o mesmo efeito terapêutico da XYS de alta dose. Entretanto, as doses baixas de XYS não melhoraram efetivamente o dano neuronal na região hipocampal CA1. Consistentemente, a apoptose dos neurônios hipocampais (CA1, CA3, DG) foi reduzida pelo tratamento com altas doses de XYS ou E2 (Figura 4). Entretanto, as doses baixas de XYS só puderam reduzir a apoptose dos neurônios CA3, mas não tiveram efeito sobre os neurônios CA1 e DG. Em conjunto, doses altas de XYS poderiam reduzir o dano neuronal no hipocampo, especialmente na região do CA1.
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Xiao-Yao-San decocção aumenta a expressão hipocampal de NMDAR2A e NMDAR2B em ratos ovariectomizados.
Plasticidade sináptica é a base neurobiológica para aprendizagem e memória a longo prazo, e o desempenho no teste MWM é influenciado pela função NMDAR . Portanto, nós estimamos ainda a expressão das subunidades NMDAR 2A e 2B no hipocampal CA1. Western blot (Figuras 5(a) e 5(b)) mostrou que a expressão de NMDAR2A e NMDAR2B foi reduzida em ratos OVX. O tratamento com XYS ou E2 aumentou significativamente o nível de expressão destas duas proteínas para o mesmo nível que o do grupo da farsa. A imunohistoquímica (Figura 5(c)) também mostrou que a proporção de células coradas positivas aumentou nos grupos de tratamento. Em comparação com o grupo salino, as doses altas de XYS aumentaram significativamente a expressão de NMDAR2A e NDMAR2B ( e 0,013, resp.), mas as doses baixas de XYS só puderam aumentar significativamente a expressão de NMDAR2A ().
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3.4. Xiao-Yao-San Decoction Activates PI3K Signaling Pathway through ERα
O impacto do E2 ou fitoestrogénios na fisiologia é mediado pela sinalização de ER. Estudos demonstraram que a ativação da cinase extracelular regulada por sinal (ERK), uma proteína cinase ativada por mitógeno, é necessária para os efeitos benéficos do E2 na memória. A fosforilação da ERK1/2 depende da ativação da PI3K . Portanto, investigamos o efeito do XYS na sinalização da ER-PI3K. Como mostrado na Figura 6, doses altas de XYS e E2 promoveram significativamente a expressão de ERα, fosforilado ERα (Ser118), e PI3K p110β (a subunidade catalítica) em comparação com o grupo salino. A ativação do ERα-PI3K reduziu ainda mais a expressão do fator pró-apoptótico Bax e melhorou a expressão do fator antiapoptótico Bcl-2. Entretanto, a baixa dose de XYS não influenciou significativamente a sinalização do ERα-PI3K, o que é consistente com os resultados das Figuras 3 e 4.
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(f) 4. Discussão
XYS tem sido usado há muito tempo para tratar a ansiedade perimenopausal e depressão. O nosso estudo explorou a nova aplicação do XYS no tratamento da deficiência cognitiva induzida por OVX. Os resultados mostraram que o XYS melhorou efectivamente a aprendizagem espacial e a memória espacial em ratos OVX. O mecanismo possível é que a XYS promove a nova síntese de estrogênio no hipocampo, ativando assim o caminho de sinalização ERα-PI3K e inibindo a apoptose dos neurônios hipocampais.
O mecanismo subjacente da XYS para o tratamento da depressão tem sido extensivamente estudado. O XYS desempenha um papel antidepressivo ao regular uma rede abrangente envolvendo neurotransmissores, neurotrofinas, eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, aminoácidos e lipídios . Alguns destes estudos têm mostrado que a XYS pode agir sobre as alterações cerebrais relacionadas com o stress. Ensaios in vitro mostraram que um soro contendo XYS poderia reverter a mudança no potencial da membrana mitocondrial, concentração de cálcio livre e taxa apoptótica de neurônios induzidos pelo estresse oxidativo . Nosso estudo mostrou que a XYS também atenuou a apoptose neuronal na região hipocondrial de ratos OVX. Os efeitos antiapoptóticos da XYS sugerem que ela tinha o potencial de atuar em uma variedade de processos patológicos relacionados à apoptose neuronal cerebral.
Os resultados de nosso estudo mostraram que a XYS poderia restaurar o nível de estrogênio no hipocampo de ratos OVX. O hipocampo é essencial para a formação da memória e é rico em ER, e o estrogênio facilita uma maior saúde cognitiva e sináptica através destas ERs. Vários ensaios clínicos indicaram a eficácia da terapia de reposição hormonal nos sintomas cognitivos relacionados com a perda de estrogénio nas mulheres . O XYS poderia aumentar o nível de estradiol no hipocampo, que deveria ser a base crucial para a sua eficácia na melhoria das capacidades cognitivas dos ratos OVX. Entretanto, a XYS não aumentou o nível sérico de estradiol. Isto pode ser porque o estradiol pode ser sintetizado de novo no hipocampo, enquanto que o estradiol sérico tem origem nas gônadas. Nossos resultados mostraram que o XYS aumentou a expressão do CYP19 no hipocampo, sugerindo que o E2 aumentado no cérebro era provavelmente derivado do hipocampo. Os resultados do nosso estudo mostraram que a expressão do XYS upregulado de NMDAR2A e NMDAR2B no hipocampo de ratos OVX. Este achado foi consistente com estudos anteriores. O estrogênio foi encontrado para aumentar tanto a densidade da coluna dendrítica quanto o número de sinapses no hipocampo através da modulação das funções NMDAR em ratos OVX. O estrogênio também poderia restaurar a morfologia do neurônio hipocampal em ratos idosos, restaurando o nível de NMDAR2B ao nível observado em nível jovem na região CA1; além disso, o estrogênio pode afetar a mobilidade do NMDAR2A e NMDAR2B através da sinapse. A ativação do NMDAR, por sua vez, poderia contribuir para a síntese do hipocampal E2, induzindo o influxo de Ca2+ .
Além dos NMDARs, XYS pode regular a expressão de outros fatores relacionados à cognição no cérebro. A perda da proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), sinaptofisina e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no hipocampo tem sido diretamente correlacionada com a aprendizagem e déficits de memória . O efeito do XYS em ratos CIS tem sido relacionado com a promoção da expressão de PSD-95 e sinaptofisina no hipocampo . O XYS também tem mostrado upregular a BDNF no córtex frontal, região hipocampal CA1 e amígdala de ratos da CIS . Durante o processo de tratamento CIS do XYS, a via de sinalização c-Jun N-terminal cinase (JNK) foi inibida no hipocampo .
Embora não tenhamos explorado especificamente qual componente é o principal ativo do XYS na aprendizagem e memória, nossos resultados sugerem que a principal fonte de fitoestrogênios no XYS é um candidato digno de mais investigação. A pesquisa de antidepressivos também nos pode fornecer algumas pistas. Jiali Liu et al. descobriram que o Bupleuri radix (Chaihu) é o principal medicamento antidepressivo na prescrição do XYS baseado na análise farmacoquímica sérica da fração éter de petróleo. Estudo in vitro mostrou que o extrato de Bupleuri radix promoveu a proliferação de células do neuroblastoma através da ativação da via PI3K/AKt . A ativação do PI3K também foi observada em nosso estudo. .
Relatos clínicos atuais mostram que o XYS tem um efeito terapêutico antidepressivo significativo, mas não há um estudo toxicológico claro sobre a toxicidade e os efeitos colaterais do XYS em detalhes. Em geral, o XYS pode ser considerado como uma prescrição sem demasiados efeitos secundários. XYS tem várias receitas modificadas, cujos ingredientes básicos são os mesmos que XYS. Uma meta-análise recente avaliou a eficácia e segurança da XYS modificada no tratamento da síndrome perimenopausal. Os resultados combinados sugerem que a XYS modificada pode ser mais eficaz e segura para o tratamento da síndrome perimenopausal em comparação com a terapia de reposição hormonal. No entanto, devido à fraca metodologia dos estudos incluídos, a eficácia e segurança da XYS necessitam de ensaios mais rigorosos para confirmação. Usando o método de ressonância magnética nuclear 1H (RMN), o grupo de pesquisa da Xiaoxia Gao relatou que a fração de éter de petróleo contendo componentes lipofílicos foi a fração mais eficaz para o tratamento da depressão . Eles também relataram que o Bupleuri Radix, o principal componente antidepressivo, poderia produzir mais efeitos tóxicos no fígado ou nos rins de ratos saudáveis do que em ratos com estresse leve crônico imprevisível. Os efeitos tóxicos foram associados ao aumento da concentração de ácido biliar, facilitação da degradação da lisina e perturbação metabólica do esfingolipídeo, glicerofosfolipídeo e ácidos graxos. Este resultado foi corroborado em um recente estudo metabólico de pacientes com depressão. A XYS desempenhou um papel antidepressivo ao regular a síntese de leucina, valina e isoleucina e o metabolismo do ácido binário, ácido gordo, argina e prolina . Estes estudos sugerem que é necessário monitorar de perto o estado do paciente com o ajuste oportuno da dose do medicamento para prevenir efeitos colaterais tóxicos.
5. Conclusões
Neste estudo, demonstramos que a alta dose do tratamento XYS teve eficácia semelhante à do E2 na melhoria das capacidades cognitivas dos ratos OVX. O efeito terapêutico foi meditado protegendo os neurônios hipocampais e restaurando o nível de E2 hipocampais. O caminho de sinalização do ERα-PI3K foi envolvido no processo. Nosso estudo sugere que a XYS poderia ser uma opção para o tratamento do comprometimento cognitivo perimenopausal. Atualmente, a XYS é utilizada principalmente no tratamento da ansiedade clínica e depressão. São necessários mais dados clínicos para verificar o seu efeito na melhoria da função cognitiva.
Dados disponíveis
Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis nos autores correspondentes, mediante solicitação.
Conflitos de interesse
Os autores declaram não ter conflitos de interesse de qualquer forma.
Contribuições dos autores
Lina Liu e Fei Ge contribuíram igualmente para esta pesquisa.
Conhecimento
Esta pesquisa foi apoiada pela National Natural Science Foundation of China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795 e 81903974); a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Subvenção nº BK20181235); o Gabinete Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Jiangsu (Subvenção nº YB2017066); o Projecto do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia de Nanjing (Subvenção nº BK20181235). 201715072); o Projecto do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Jiangsu (Subvenção n.º Y2018CX09); e um Projecto financiado pelo Desenvolvimento do Programa Académico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.