Biol Res 41: 197-204, 2008
ARTICLE
Diferenças em lipogênese e lipólise em adipócitos humanos adultos obesos e não-obesos
MARIANA CIFUENTES, CECILIA ALBALA e CECILIA V ROJAS
Instituto de Nutrição e Tecnologia Alimentar (INTA), Universidad de Chile, Santiago, Chile.
Dirección para Correspondencia
ABSTRACT
Propõe-se que as diferenças na função adipocitária e/ou metabolismo entre individuáis obesos e indivíduos magros podem manifestar-se em anormalidades funcionais do tecido adiposo que levam a distúrbios metabólicos na obesidade. Estudamos lipogênese e lipólise de adipócitos omentais de humanos obesos (OB) e não-obesos (NOB). A atividade específica da enzima marcadora lipogênica G3PDH foi 50% menor no total de adipócitos da obstetrícia em comparação com a dos indivíduos NOB. Os adipócitos omentais dos sujeitos OB também tiveram levéis lipolíticos basais inferiores, e uma resposta lipolítica inferior ao estímulo p-adrenérgico. O esgotamento do colesterol da membrana plasmática dos adipócitos usando metilciclodextrina β causou um efeito lipolítico nos adipócitos dos dois grupos juntos, mas quando os indivíduos obesos e magros foram analisados separadamente, a resposta foi significativa apenas nos obesos. Apresentamos evidências de um perfil lipogênico e lipolítico diferente nos adipócitos omentais de indivíduos obesos, e propomos um papel relevante do colesterol da membrana plasmática, onde o impacto de sua remoção na lipólise dos adipócitos OB e NOB é diferente.
Termos chave: adipócitos, colesterol, lipogênese, lipólise, obesidade, metabolismo de triglicérides.
INTRODUÇÃO
O excesso de tecido adiposo visceral está ligado a inúmeros problemas de saúde. Uma adiposidade aumentada está associada ao aumento do volume das células adiposas. Assim, os indivíduos obesos têm uma quantidade relativamente grande de adipócitos hipertróficos em comparação com indivíduos magros. Estudos sobre células adipócitas animais e humanas estabeleceram que várias funções metabólicas dos adipócitos são alteradas com um tamanho celular maior, como a sensibilidade à insulina e o metabolismo da glicose, além dos perfis de secreção adipocina e expressão gênica (Bluher et al., 2004; Salans e Doherty, 1971; Salans et al., 1974; Smith, 1971; Yang et al., 2004). Isto levou à sugestão de que a predominância funcional de células hipertróficas e/ou metabólicas no tecido adiposo é um importante efeito causal para uma baixa resposta do tecido aos signáis homeostáticos, perpetuando ou exacerbando assim o estado obeso. A fim de testar esta hipótese, nós nos propusemos a estudar a lipogênese e lipólise in vitro em adipócitos omentais isolados de adultos OB e NOB. Dado que a sinalização da lipólise depende de proteínas localizadas em cavernas, e que a perturbação da organização dessas estruturas ricas em colesterol tem sido associada a alterações metabólicas em adipócitos obesos (Le Lay et al, 2004), também avaliamos o impacto da remoção do colesterol da membrana plasmática usando metil (β-cyclodextrin (M(βCD) em OB e NOB lipólise de adipócitos.
Os resultados atuais ressaltam um perfil lipogênico e lipolítico diferente entre indivíduos magros e obesos. Nossos dados evidenciam a relevância metabólica do menor teor de colesterol da membrana plasmática em adipócitos de obesos, afetando a regulação fisiológica da lipólise.
MATERIAIS E MÉTODOS
Isolamento de Adipócitos
Gordura omental humana foi obtida de 25 obesos (OB) e não obesos (NOB) submetidos à cirurgia abdominal eletiva (bypass gástrico, ginecológico ou gastrintestinal). A faixa etária dos sujeitos foi de 29-79 anos e seu índice de massa corporal (IMC) variou entre 18 e 54 kg/m2. O ponto de corte para definir obesidade foi considerado de acordo com a definição de IMC NIH > 30 kg/m2. Doze sujeitos (9 homens, 3 mulheres) eram NOB (IMC 23,3 ±3,4 kg/m2), enquanto 13 eram OB (IMC 38,2 ± 4,3 kg/m2; 4 homens, 9 mulheres). Não observamos nenhuma influência do gênero nos parâmetros estudados. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do INTA, Universidade do Chile, e o consentimento informado foi assinado pelos doadores. O tecido adiposo removido durante a cirurgia foi imerso em solução salina e transportado para o laboratório para ser processado em uma hora. Na chegada, o tecido foi lavado várias vezes com solução salina balanceada (HBSS) de Hanks, removendo todo o tecido conjuntivo visível, coágulos e vasos, e depois picado em pequenos pedaços (2-3 mm2) e cultivado em médium MI99 (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com antibióticos (penicilina-estreptomicina) a 37°C em uma incubadora de atmosfera controlada. Houve um período de incubação de 2 dias do tecido a fim de minimizar a variabilidade interindividual causada por fatores sujeitos como o meio hormonal, estado de saúde atual ou medicamentos. Os adipócitos foram isolados usando um método baseado no trabalho de Rodbell (1964). Em resumo, o tecido adiposo picado foi incubado com colagenase lg/1 tipo I (Worthington Biochemical Corp. Lakewood, NJ) a 37°C durante 60 min com mistura contínua. A suspensão celular resultante foi filtrada através de uma gaze esterilizada, e como os adipócitos separam espontaneamente da fase aquosa, foram recuperados aspirando suavemente a camada flutuante com uma pipeta plástica, e lavados duas vezes com 5 volumes de HBSS. Adipócitos isolados foram imediatamente usados para estudos de lipólise, ou congelados para determinação posterior de glicerol-β-fosfato desidrogenase (G3PDH).
A resposta lipolítica ao (β-adrenergic stimulus and detection of lipogenic activity (see below) evidenced the presence of viable adipocytes after the digestión of the tissue.
Lipogénese e Lipólise
A síntese de triglicéridos no adipócito utiliza ácidos gordos pré-fabricados e de novo-fabricados, enquanto que a espinha dorsal do glicerol provém do glucose-derivado glicerol-β-fosfato. A capacidade lipogénica foi avaliada pela actividade específica da enzima G3PDH, que catalisa a formação da espinha dorsal de glicerol dos triglicéridos a partir do fosfato de di-hidroxiacetona fornecido através da glicólise. Esta enzima é considerada limitadora da taxa de síntese dos triglicéridos no tecido adiposo, dado que neste tecido é a fonte solitária de glicerol-β-fosfato. Seu uso como marcador lipogênico em adipócitos maduros é apoiado pela upregulação de seu mRNA e atividade pela insulina (Moustaid et al., 1996; Rumberger et al., 2003). Em resumo, os adipócitos isolados foram homogeneizados (10 AVC a 1800 rpm com um sistema homogeneizador Glas-Col, Glas-Col, IN) usando um tubo de vidro equipado com um pilão de teflon, a 4°C em um tampão contendo 0,25M de sacarose, EDTA lmM, 50mM de trietanolamina e ditiotreitol lmM. O homogeneizado foi centrifugado a 14.000 x g, a 4°C durante 30 min. A actividade de G3PDH foi determinada no sobrenadante com base no método de Kozak e Jensen (1974), medindo a oxidação NADH (curso temporal da mudança de absorvância a 340 nm a 37°C) num leitor de microplacas (EL-808, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT), utilizando fosfato de di-hidroxiacetona como substrato para a enzima. A reação foi linear em relação ao tempo durante o período do ensaio. Uma unidade de atividade enzimática corresponde à oxidação de 1 nmol de NADH por minuto nas condições indicadas acima. A concentração de proteínas no extrato solúvel foi medida pelo método de Bradford (Bradford, 1976).
Lipólise foi avaliada durante as 48 horas de cultura adiposa pela medida do glicerol cumulativo liberado no médium de cultura MI99 (reagente de determinação de glicerol livre, Sigma, St Louis MO). Além disso, a resposta lipolítica aguda ao (β-adrenergic stimulus, com ou sem esgotamento do colesterol da membrana plasmática (60 min préincubação com 10 mM MβCD ), foi avaliada pela medição do glicerol total liberado durante uma incubação de 90 minutos de suspensões adipócitas de 10% a 37°C com suave turbilhonamento contínuo e a adição de 10μM isoproterenol (Sigma) ou veículo. Para avaliação da lipólise durante a cultura de tecido adiposo, os valores de glicerol são expressos por mg de tecido, enquanto para o ensaio de lipólise em suspensões adipocitárias, os valores são normalizados para lipídios celulares totais, como descrito por Carpéné (2001) ou, em experimentos com agentes lipolíticos, para o respectivo controle basal (não estimulado). Os lipídios celulares totais foram extraídos pelo método de Dolé e Meinertz (1960), e determinados gravimetricamente. À luz de uma relação independente relatada entre o tamanho celular e a lipólise, que pode atuar como um confundidor, especialmente em nossos estudos comparando sujeitos OB e NOB, a expressão por mg lipídico foi considerada a mais adequada. Como mostrado por Large et al. (1999), a glicerol reléase expressa por conteúdo lipídico está altamente correlacionada com a atividade da lipase sensível ao hormônio em estudos com sujeitos humanos obesos e magros, e mais relevante para a capacidade lipolítica do que por número de células devido ao aumento do volume de células gordurosas nos obesos.
Estatística
As diferenças entre as médias foram analisadas através do teste t de Student e foram consideradas significativas em p≤0.05. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar as associações para variáveis contínuas. Os dados são expressos como médias ± SEM.
RESULTADOS
Lipogênese
Atividade específica da enzima lipogênica G3PDH foi quase metade em sujeitos OB, em comparação com a dos adipócitos da NOB (p<0,05, Fig. 1). Consistente com isso, houve uma correlação inversa significativa entre o marcador de lipogênese e o IMC dos sujeitos (Fig. 1, inset, r2=0,31, p=0,01). Vale ressaltar que não houve diferenças na concentração de proteínas (utilizadas para normalizar a atividade de G3PDH) entre sujeitos OB e NOB que poderiam ter enviesado esses resultados.
Lipólise
A reléase de glicerol ao médium de incubação durante a cultura de tecido adiposo omental inteiro ou adipócitos isolados foi usada como um indicador de atividade lipolítica. Tanto a lipólise basal quanto a estimulada por isoproterenol foram menores em adipócitos isolados de sujeitos OB (p<0,05 e p<0,01, respectivamente, Fig. 2). Consistente com estas observações, houve uma correlação inversa altamente significativa entre lipólise e IMC do sujeito para tecido inteiro (r2=0,46, p<0,0005, inset, Fig. 2) e adipócitos isolados (basal: r2=0,28, p<0,01; β-adrenérgico-estimulado: r2=0,17, p<0,05, n=20). Adipócitos de indivíduos obesos mostraram uma resposta menor aos (β-adrenérgicos estimulados em comparação com aqueles de seus pares magros (Fig. 3, p<0,05).
Exposição de adipócitos a 10 mM MβCD num subconjunto de 11 amostras causou um aumento significativo na lipólise basal. Este aumento foi diretamente proporcional ao IMC do sujeito (r2=0,5, p<0,05, Fig. 4). A resposta lipolítica à (β-adrenergic stimulation was significantly reduced when adipocytes were exposed to M(βCD (345 ± 50 % vs. 199 ± 33 %, respectivamente, p< 0,05). Curiosamente, ao comparar o efeito do M(βCD versus veículo, uma redução significativa na resposta lipolítica ao isoproterenol foi observada em adipócitos de indivíduos com IMC>40 kg/ m2 (obesos mórbidos, de acordo com a definição do NIH), enquanto indivíduos magros não mostraram diferença significativa (Fig. 5). Consistente com isto, uma correlação significativa foi encontrada entre o IMC e a razão de resposta lipolítica para 10μM isoproterenol na presença e ausência de 10 mM M(βCD (r2=0,46, p<0,05).
DISCUSSÃO
No presente trabalho, estudamos a lipogênese e lipólise em adipócitos isolados de tecido adiposo omental de adultos OB e NOB dentro de uma ampla faixa de IMC (18-54 kg/m2). Nossas observações mostram que a atividade específica do marcador de lipogênese G3PDH no OB foi metade da atividade nos adipócitos de seus homólogos NOB. Por outro lado, IMCs maiores foram associados a lipólise basal inferior e (β-adrenérgico-estimulada e uma maior sensibilidade ao comprometimento da membrana plasmática de sinalização devido à remoção do colesterol. Um maior acúmulo de triglicérides no adipócito OB pode estar relacionado à menor atividade lipolítica que observamos neste grupo, como outros também propuseram (Langin et al., 2005). Além disso, a menor atividade específica de G3PDH que encontramos na OB, que pode resultar contraintuitiva, pode representar uma diminuição da capacidade de armazenamento do excesso de triglicerídeos circulantes, provavelmente resultando em hipertrigliceridemia e acúmulo de gordura em outras regiões do corpo, com os conhecidos efeitos prejudiciais associados à síndrome metabólica.
Usando uma abordagem in vivo em humanos, Dodt et al. (2003) observaram uma resposta lipolítica embotada à estimulação intraneural em fêmeas obesas, o que é consistente com nossos resultados in vitro e suporta a noção de que a obesidade pode estar, pelo menos em parte, associada a uma baixa resposta lipolítica à ativação simpática. De acordo com Gómez-Ambrosi et al. (2004) estudaram o padrão de expressão gênica do tecido adiposo omental e mostraram que indivíduos obesos tinham diminuído e aumentado a expressão dos genes indutor e repressor de lipólise, respectivamente.
Existe uma discrepância considerável na literatura em relação à normalização dos dados de lipólise. Dada a relação direta relatada entre o tamanho das células adipócitas e a lipólise (Large et al., 1999), e a maior abundância relativa de adipócitos maiores nos obesos (Large et al., 1999), espera-se que o tecido adiposo apresente maior lipólise não ajustada entre os obesos do que entre os indivíduos NOB. Assim, para evitar um fator de confusão devido à diferente distribuição do tamanho celular em OB versus NOB, nossos valores de glicerol reléase foram normalizados expressando-os por mg de lipídio total, avaliando assim a atividade lipolítica para uma determinada massa lipídica. Apoiando isso, estudos com humanos obesos e magros observaram uma alta correlação entre a atividade da enzima chave lipolítica HSL (hormônio sensível Upase) e a glicerol reléase adipocitária expressa por conteúdo lipídico (Large et al., 1999). Os autores afirmaram que o conteúdo lipídico é mais relevante para a capacidade lipolítica do que a normalização por número de células, devido ao aumento do volume de células adipócitas nos obesos. Vale ressaltar que (β-adrenergic stimulation over basal conditions also proved to be lower in OB subjects, and this assessment is independent of cell size or number, given that it is normalized with the corresponding control (each basal valué).
The role of membrane cholesterol content for caveolae integrity, specific signal transduction and proper cell function has already been recognised (Le Lay et al. 2001). Foi demonstrado que os adipócitos hipertróficos têm um metabolismo comprometido, juntamente com um menor conteúdo de colesterol na membrana plasmática (Le Lay et al. 2001). As nossas observações expandem as de Le Lay et al. (2001, 2004) que mostrou que a diminuição do colesterol nos adipócitos induz a resistência à insulina e mudanças na expressão de vários genes relevantes para o metabolismo da adipose. Estes resultados foram fornecidos como evidência da redução do colesterol na membrana plasmática como uma ligação entre a hipertrofia dos adipócitos e o comprometimento metabólico, o que é apoiado pelos nossos resultados atuais. Nossas experiências expondo adipócitos a M(βCD causaram um aumento significativo na lipólise basal (esperada após a alteração da integridade das cavernas da membrana plasmática, resultando em uma diminuição da atividade da fosfodiesterase 3B) e, consequentemente, em uma resposta lipolítica reduzida ao (β-adrenergic stimulus. Curiosamente, observamos uma associação significativa entre o impacto da M(βCD na lipólise basal e o IMC. Além disso, a correlação significativa entre o IMC e a relação entre isoproterenol e lipólise basal na presença e ausência de M(βCD suporta uma maior suscetibilidade dos adipócitos de indivíduos obesos à alteração da sinalização da membrana plasmática acionada pelo colesterol.
Células gordurosas aumentadas, conhecidas por serem mais abundantes como aumento do IMC dos indivíduos (Julien et al., 1989; Salans et al., 1973; Van Harmelen et al, 2003) são resistentes à insulina (Olefsky 1977) e mostram um padrão de secreção distinto que os ligou a distúrbios associados à obesidade (Imbeault et al., 1999; Van Harmelen et al., 2000).
Interessantemente, os ratos knockout receptores de insulina específicos do tecido adiposo (Bluher et al.., 2004) mostram polarização dos adipócitos em duas subpopulações de células pequenas (<50μm diâmetro) e grandes >1OOμm), que é acompanhada por diferenças na síntese de triglicérides e lipólise, entre outros parâmetros. As observações aqui relatadas mostram diferenças intrínsecas no metabolismo dos triglicérides entre os adipócitos omentais de sujeitos OB e NOB, e propomos que o enriquecimento em adipócitos hipertrofiados e de membrana com privação de colesterol pode estar impulsionando tais alterações. É possível que a resposta lipolítica prejudicada contribua a tempo para o aumento do depósito de triglicéridos. A capacidade reduzida de armazenar triglicérides adicionais, resultaria em um aumento da quantidade de lipídios circulantes, elevando os riscos associados à síndrome metabólica.
Até o melhor de nosso conhecimento, nenhum outro estudo avaliou lipogênese e lipólise em adipócitos omentais de sujeitos humanos OB e NOB. O presente trabalho mostra diferenças relevantes no metabolismo de triglicérides de adipócitos omentais em indivíduos obesos em comparação com indivíduos não obesos e sugere que os adipócitos de individuáis obesos são mais suscetíveis à redução do teor de colesterol na membrana plasmática. Apesar de pretendermos minimizar os factores do sujeito, não podemos excluir que as comorbilidades presentes nos indivíduos obesos possam estar a influenciar o diferente comportamento das células adiposas. A comparação da manipulação de triglicéridos entre estes grupos e em um depósito de gordura de tal relevância patogênica ajuda a entender as diferenças no metabolismo e na responsividade, que podem ser alvo de intervenção farmacológica e exigir mais estudos.
ACENTIFICADORES
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Miguel A. Celis do Hospital Tisné, ao Dr. Leonardo Rodríguez do Hospital DIPRECA e aos Drs. Cristian Cavalla, James Hamilton e Gonzalo Wiedmaier do Hospital Padre Hurtado pela inestimável ajuda na obtenção de tecido adiposo, assim como à Sra. Marisol Blanco e Rodrigo Brücher pela sua assistência técnica.
SUPORTE GRANTE
Patrocinado por doações do DI-U de Chile (N°s Mult 04/06-2 a C. Rojas e 1-04/01-2 a M. Cifuentes), e FONDECYT (N° 1070632 a C. Rojas, N°1080232 a M. Cifuentes).
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