Como funciona a Cromatografia de Intercâmbio de Íons?

A cromatografia de troca iónica (IEX) é uma técnica comumente usada na purificação de biomoléculas. Ela envolve a separação de moléculas com base em sua carga.

Esta técnica explora a interação entre moléculas carregadas em uma amostra e moieties carregadas de forma oposta na fase de papelaria da matriz cromatográfica. Este tipo de separação é difícil utilizando outras técnicas, pois a carga é facilmente manipulada pelo pH do tampão utilizado.

Dois tipos de separação de troca iônica é possível – troca catiônica e troca aniônica. Na troca aniônica a fase estacionária é carregada positivamente enquanto na troca catiônica é carregada negativamente.

Princípio da Cromatografia de Troca Iônica

Cromatografia IEX é usada na separação de biomoléculas carregadas. A amostra bruta contendo moléculas carregadas é usada como fase líquida. Quando ela passa pela coluna cromatográfica, as moléculas se ligam a locais com cargas opostas na fase estacionária.

As moléculas separadas com base na sua carga são eluídas usando uma solução de força iônica variável. Ao passar tal solução pela coluna, ocorre a separação altamente seletiva das moléculas de acordo com suas diferentes cargas.

A Técnica

Passos-chave no procedimento de cromatografia de troca iônica são listados abaixo:

• Uma amostra de proteína impura é carregada na coluna de cromatografia de troca iônica a um determinado pH.
• Proteínas carregadas ligam-se aos grupos funcionais carregados de forma oposta na resina
• Um gradiente de sal é usado para eluir proteínas separadas. A baixas concentrações de sal, proteínas com poucos grupos carregados são eluídas e a altas concentrações de sal, proteínas com vários grupos carregados são eluídas.
• Proteínas indesejadas e impurezas são removidas por lavagem da coluna.

Um gradiente de pH também pode ser aplicado para eluir proteínas individuais com base no seu ponto isoelétrico (pI), ou seja, o ponto no qual os aminoácidos de uma proteína carregam carga neutra e, portanto, não migram em um campo elétrico. Como os aminoácidos são compostos iônicos zwitter, eles contêm grupos com cargas positivas e negativas. Com base no pH do ambiente, as proteínas transportam uma carga positiva, negativa ou nula. Em seu ponto isoelétrico, elas não irão interagir com as moieties carregadas na resina da coluna e, portanto, são eluídas. Um gradiente de pH decrescente pode ser usado para eluir proteínas usando uma resina de troca aniônica e um gradiente de pH crescente pode ser usado para eluir proteínas de resinas de troca catiônica. Isto porque o aumento do pH tampão da fase móvel faz com que a proteína se torne menos protonada (menos positivamente carregada), de modo que não pode formar uma interação iônica com a resina carregada negativamente, permitindo a eluição. Por outro lado, a redução do pH da fase móvel fará com que a molécula se torne mais protonada (menos carregada negativamente_, permitindo sua eluição.

Seleção de resina em cromatografia de troca iônica

Resinas de troca iônica têm grupos funcionais carregados positiva ou negativamente, covalentemente ligados a uma matriz sólida. As matrizes são geralmente feitas de celulose, poliestireno, agarose e poliacrilamida. Alguns dos fatores que afetam a escolha da resina são: anion ou trocador catiônico, taxa de fluxo, trocador iônico fraco ou forte, tamanho da partícula da resina e capacidade de ligação. A estabilidade da proteína de interesse dita a seleção de um ânion ou de um trocador catiônico – qualquer um dos trocadores pode ser usado se a estabilidade não for preocupante.

As aplicações da cromatografia de troca iônica

A troca iônica é o método cromatográfico mais usado para a separação e purificação de biomoléculas carregadas, tais como polipéptidos, proteínas, polinucleotídeos e ácidos nucléicos. Sua ampla aplicabilidade, alta capacidade e simplicidade, e sua alta resolução são as razões chave para seu sucesso como método de separação. A cromatografia de troca iônica é amplamente utilizada em diversas aplicações industriais, algumas das quais são as seguintes:

• Separação e purificação de componentes sanguíneos como albumina, fatores de crescimento recombinantes e enzimas.

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• Biotecnologia – Aplicações analíticas como controle de qualidade e monitoramento de processos
• Pesquisa alimentar e clínica – para estudar variedades de trigo e a correlação da proteinúria com diferentes doenças renais.
• Fermentação – Resinas de troca catiônica são usadas para monitorar o processo de fermentação durante a produção de ß-galactosidase.

Outras Leituras

• Cromatografia de alto rendimento em cromatografia
• Cromatografia geral
• Cromatografia a gás – Espectrometria de massa (GC-MS) Aplicações
• Cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC)
• Cromatografia líquida -Espectrometria de massa (LC-MS) Aplicações

Citações