Citrobacter freundii fitness durante infecção da corrente sanguínea

Collection of Citrobacter BSI isolates

Comparado com outras espécies Gram-negativas que causam BSI regularmente, há poucas informações disponíveis a respeito da fisiologia de C. freundii dentro do ambiente hospedeiro. Com o objetivo de resolver essa deficiência, primeiramente coletamos oito isolados pertencentes ao complexo C. freundii de pacientes com BSI dentro do Sistema de Saúde da Universidade de Michigan. A filogenia baseada em RNA Ribosomal é capaz de distinguir três grupos de espécies de Citrobacter, dos quais o grupo I engloba pelo menos oito espécies e inclui C. freundii23,24. No entanto, 16S rRNA seqüência e abordagens de identificação baseadas em espectrometria de massa oferecem resolução filogenética limitada dentro deste grupo de espécies de Citrobacter. Portanto, os isolados utilizados neste estudo foram avaliados com uma abordagem de análise de sequência multilocus. Entre os oito isolados coletados, seis se agruparam estreitamente com cepas estabelecidas de C. freundii (Fig. 1) e tinham uma identidade média de nucleotídeos de >98% com o tipo de cepa ATCC 8090, que está acima do corte tipicamente aceito de 95% para isolados da mesma espécie. Dos dois isolados restantes, UMH17 agrupou-se mais estreitamente com a estirpe tipo Citrobacter pasteurii CIP 55,13 e UMH18 com as estirpes Citrobacter werkmanii.

C. freundii bacteremia

Prior para investigar os requisitos de aptidão física do Citrobacter durante a BSI, um modelo murino de bacteremia foi desenvolvido com base em trabalhos anteriores com outras espécies entéricas25. Entre os isolados do Citrobacter BSI, as cepas UMH14 e UMH15 foram escolhidas como candidatas para uso neste estudo. O UMH14 isolado exibiu uma colonização mais consistente dose-dependente do baço e fígado às 24 horas após a injeção da veia caudal (Fig. S1) e foi selecionado para posterior caracterização. Também foi necessário testar o modelo de infecção para potenciais gargalos de colonização antes de avaliar a contribuição dos genes individuais de C. freundii para a aptidão, usando uma grande coleção de mutantes transpositores. Um mutante espontâneo resistente a ácido nalidíxico de UMH14 (UMH14Nal) foi isolado e determinado como tendo uma aptidão in vitro equivalente durante a co-cultura com a estirpe mãe em meio rico (Fig. S2). Para determinar se uma população diversificada de mutantes poderia ser estabelecida na corrente sanguínea sem perda estocástica de clones individuais, as cepas UMH14Nal e UMH14 foram misturadas em diferentes proporções e inoculadas em camundongos. Após 24 horas, proporções de até 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) foram toleradas sem perda espontânea da cepa sub-representada no baço (Fig. S2), indicando que um único rato poderia acomodar pelo menos 10.000 mutantes transpositores únicos com uma dose total de 5 × 107 bactérias usando este modelo.

Para identificar os genes de aptidão bacteriana no modelo de bacteremia, cinco conjuntos de mutantes de inserção aleatória de transposões representando >44.000 locais únicos de inserção foram injetados em ratos e as bactérias colonizadoras do baço foram recuperadas após 24 horas (Fig. S3). A relativa abundância de mutantes transpositores individuais no inóculo e saídas esplênicas, determinada pelo sequenciamento de alto rendimento, foi utilizada para identificar genes que contribuem para a sobrevivência bacteriana no modelo. Um total de 177 genes transposon-disrupted conferiu uma perda significativa da aptidão bacteriana e nove genes foram associados com o aumento da aptidão bacteriana quando mutantes (fold-change ≥2.0, Adj. P < 0.05) (Dados S1). Uma segunda análise com este conjunto de dados identificou 546 genes essenciais cromossomicamente codificados para os quais o número de leituras na população de entrada foi significativamente menor do que o esperado com base nos locais de AT disponíveis e no tamanho da população da biblioteca (logFC <-5,17) (Dados S2). Usando este modelo de infecção oportunista e sistêmica, foi antecipado que a maioria dos fatores de aptidão física identificados representariam processos fisiológicos essenciais ao invés de fatores de virulência prototípicos (por exemplo, toxinas proteicas ou aderências). De facto, a categorização dos 177 genes associados a defeitos significativos de aptidão física por Clusters of Orthologous Groups (COG) reflectiu a predominância de vias metabólicas e funções de manutenção celular necessárias durante a bacteremia de C. freundii (Fig. 2). Aproximadamente metade dos genes de aptidão física identificados se encaixam amplamente dentro de cinco categorias de COG, abrangendo produção de energia, metabolismo de aminoácidos, replicação e reparo do DNA, tradução e biogênese da parede celular e membrana.

Validação de mutantes de genes de condicionamento físico individuais

A contribuição de produtos de genes individuais para o condicionamento físico de C. freundii foi confirmada com mutações independentes de supressão-inserção construídas em genes UMH14 selecionados (Tabela 1). Todas as linhagens de engenharia aqui relatadas não apresentavam defeitos de replicação grosseiros conforme determinado pelo crescimento em meio rico (Fig. S4). Para cada gene listado na Tabela 1, a adequação foi medida pela co-infecção de mutantes individuais com a cepa UMH14 dos pais. Cinco dos sete mutantes inicialmente testados apresentaram uma desvantagem competitiva estatisticamente significativa tanto no baço quanto no fígado (Fig. 3A), afirmando, assim, os resultados da tela de transposição. O mutante znuB foi selecionado como controle negativo para validação aqui, uma vez que os resultados da tela de transposição indicaram que nenhum defeito de aptidão foi associado a este gene, apesar das evidências de outras espécies bacterianas demonstrando a contribuição do sistema de transporte de zinco ZnuABC para a infecção murina26,27,28. Em competição com UMH14, o mutante znuB mutante não apresentou um defeito de aptidão significativa, em concordância com os resultados esperados. Os genes adjacentes znuA (fold-change = 1,5, Adj. P = 0,527) e znuC (fold-change = 2,0, Adj. P = 0,035) do UMH14 também conferiram ou não um defeito de aptidão física ou um defeito mínimo quando mutado por inserção de transposon (Data S1).

Mutação do gene tatC, codificando um componente do sistema de translocação de gêmeos, resultou na maior perda de aptidão entre todos os mutantes testados (Fig. 3). Para determinar se a diminuição da aptidão física deste mutante poderia ser restaurada através da complementação genética, o plasmídeo pBBR1MCS-5 que abriga o quadro de leitura aberta do tatC foi introduzido no mutante tatC e a aptidão física relativa da estirpe resultante foi testada. O mutante tatC apresentou inicialmente um defeito de aptidão física 67 vezes no baço em competição com a estirpe do tipo selvagem (Fig. 3A), enquanto o mutante tatC complementado apresentou apenas um defeito de aptidão física duas vezes maior sob as mesmas condições (Fig. 3B). Da mesma forma, o mutante tatC complementado não foi significativamente superado no fígado em relação ao UMH14. Sabe-se que o plasmídeo pBBR1MCS-5 pai é mantido de forma estável durante a infecção na ausência de seleção29 e a cultura in vitro do C. freundii tatC mutante abrigando o pBBR1MCS-5 ou o plasmídeo de complementação tatC+ não demonstrou perda apreciável de plasmídeo durante 24 horas na ausência de seleção (Fig. S5). Juntos, esses resultados estabelecem firmemente a necessidade da função TatC durante a bacteremia por Citrobacter.

Conservação dos genes de aptidão entre os isolados de Citrobacter

Durante o curso deste estudo, a sequência completa do genoma de cada isolado de Citrobacter foi determinada e o proteoma previsto de cada estirpe foi comparado contra UMH14 como referência. Dos 4.666 produtos gênicos previstos codificados no cromossomo UMH14, 3.742 são conservados em ≥95% de identidade entre todos os isolados de C. freundii neste estudo (Fig. 4A). O número de proteínas conservadas (≥95% identidade) entre todas as linhagens diminui para 2.545 quando os proteomas previstos de UMH17 e UMH18 foram incluídos, consistente com a colocação desses isolados fora do ramo de C. freundii por análise de sequência multilocus (Fig. 1). A conservação dos fatores de adequação UMH14 também foi alta, com 145 das 177 proteínas previstas conservadas em ≥95% de identidade de aminoácidos entre as oito cepas de bacteremia (Fig. 4B), incluindo todos os sete fatores de adequação inicial que foram selecionados para validação (Tabela 1 e Fig. 3). A remoção de UMH17 e UMH18 da consideração aumentou o número de fatores de aptidão física conservados para 162 (92%). Estes resultados sugerem uma estratégia de sobrevivência do Citrobacter durante a bacteremia que depende em grande parte das proteínas conservadas dentro da espécie. Curiosamente, poucos factores de aptidão física foram completamente únicos (<30% de identidade) para UMH14 dentro deste subconjunto de estirpes. Um exemplo notável é um putativo operon de três genes (CUC46_23440-CUC46_23450) com defeitos de aptidão física observados variando entre 6 e 14 vezes. Todos os três quadros de leitura abertos codificam proteínas hipotéticas e entre estas apenas a CUC46_23450 está prevista a codificação de um domínio conservado com uma função atribuída (cd01713, phosphoadenosina fosfossulfato redutase).

Percursos de recombinação e reparação de DNA

Um dos objetivos deste estudo foi identificar caminhos biológicos conservados que envolviam múltiplos fatores de aptidão bacterêmica. Os complexos enzimáticos RecBCD e RuvABC que estão envolvidos na recombinação e reparo do DNA representam esse exemplo. A enzima RecBCD é ativa em pontas de DNA duplex e é necessária para os processos de recombinação homóloga e reparo de DNA recombinacional. Em relação a estas funções, a enzima RuvABC facilita a migração e resolução do ramo de junção de Holliday30,31. A inserção do transposon no recB, recC ou recD resultou em uma redução de 6-8 vezes na aptidão física e, da mesma forma, a interrupção do ruvA e do ruvC pela inserção do transposon resultou em uma perda de aptidão física de >30 vezes (Dados S1). Importante, o defeito de aptidão ruvA foi confirmado pela infecção de competição contra a estirpe do tipo selvagem usando um mutante de construção independente (Fig. 3A). Dentro dos dois complexos multi-proteínas, apenas o RuvB não foi identificado como um fator de condicionamento físico significativo em nosso conjunto de dados. Ambos os complexos proteicos são conhecidos por participarem da resolução de garfos de replicação de DNA estagnados ou colapsados que ocorrem durante a síntese cromossômica normal30, embora importante, o mutante ruvA cresceu similarmente à cepa do tipo selvagem durante a rápida replicação em meio rico (Fig. S4). É tentador especular que os danos de DNA bacteriano que ocorrem no ambiente hospedeiro, potencialmente através da produção de espécies de oxigênio reativas mediadas por células imunes, também podem contribuir para a necessidade desses complexos.

O sistema de translocação de gêmeo-arginina

O sistema de translocação de gêmeo-arginina funciona em espécies bacterianas Gram-negativas para secretar proteínas dobradas através da membrana citoplasmática. O papel da TatC neste sistema multi-proteínas conservado está no reconhecimento de sequências de sinal de secreção para proteínas que são exportadas através desta via. Tendo estabelecido o impacto significativo do gene tatC na aptidão in vivo de C. freundii (Fig. 3), foi argumentado que as proteínas secretadas pelo sistema Tat também podem ser necessárias para a aptidão no modelo murino. Para identificar proteínas putativas segregadas por Tat, a seqüência N-terminal de cada um dos 177 fatores de condicionamento físico foi analisada utilizando o software de predição TatP 1.032. Dois genes, CUC46_16565 e CUC46_16060, foram identificados como codificando peptídeos de sinal dependentes de Tat contendo motivos de gêmeos-arginina. O produto CUC46_16565 compartilha 94% de identidade de aminoácidos com a proteína E. coli SufI, incluindo 100% de conservação do motivo da gêmea-arginina e porção hidrofóbica do peptídeo de sinal33. O gene C. freundii sufI foi mutado e a adequação foi avaliada em competição com a estirpe UMH14 dos pais para determinar se algum defeito de adequação associado com a perda de TatC poderia ser atribuído à interrupção da função SufI (Fig. 5A). De facto, a estirpe mutante sufI foi superada por 7 vezes no baço e 17 vezes no fígado em comparação com a estirpe selvagem. No entanto, como o custo da mutação tatC variou de 67 a 112 vezes em competição com bactérias do tipo selvagem (Fig. 5A), a mutação tatC foi superada por 7 vezes no baço e 17 vezes no fígado. 3), o custo comparativamente baixo da mutação sufI implicou que substratos adicionais dependentes do Tat podem também contribuir para a aptidão física. As tentativas de estabelecer a secreção de SufI dependente de Tat em C. freundii foram infrutíferas devido a problemas de toxicidade aparente associados à expressão de uma construção de SufI com marcação de epitiope FLAG terminal, especificamente dentro da estirpe mutante TatC (dados não mostrados). Entretanto, a SufI tem sido usada como um modelo de proteína secretada por Tat em numerosos estudos caracterizando o sistema E. coli Tat.

O segundo fator de aptidão física potencial Tat-secreted que foi identificado, codificado por CUC496_16060, é um aminopeptidase prolineado previsto (PRK10879) pertencente à superfamília PepP. Uma estirpe mutante sem o gene pepP foi superada por cerca de 3 vezes no baço e cerca de 2 vezes no fígado, mas a desvantagem observada de aptidão física em relação ao tipo selvagem não foi estatisticamente significativa (Fig. 5A). No entanto, a localização subcelular da PepP foi determinada por meio de uma derivada epitopada C-terminal FLAG transportada em um plasmídeo multi-cópia (PepPFLAG). Níveis inesperadamente baixos de PepPFLAG foram detectados no mutante tatC comparado ao UMH14; entretanto, a proteína de fusão da PepPFLAG foi encontrada principalmente na fração citoplasmática de ambas as cepas testadas (Fig. S6) e nenhuma evidência de localização subcelular dependente de Tat da proteína PepP foi obtida. Juntamente com os resultados da infecção por competição sufI mutante, esses dados suportam ainda mais a noção de que fatores adicionais de adequação dependentes de Tat estão presentes em C. freundii ou que a perda cumulativa da translocação da proteína através do sistema Tat supera a perda de função para qualquer substrato único.

Um dos fenótipos predominantes associados à perda de função dos mutantes Tat entre as espécies é uma diminuição da motilidade34,35,36,37. C. freundii é uma bactéria flagelada capaz de nadar em uma matriz de ágar macio. A C. freundii tatC mutante apresentou uma redução de aproximadamente 2 vezes na motilidade de natação em comparação com a cepa do tipo selvagem e a motilidade de natação foi totalmente restaurada pela complementação genética em trans (Fig. 5B,C). Esses resultados demonstram claramente um defeito de motilidade na ausência da função TatC; entretanto, como o nadar de baixo nível ainda foi observado no mutante tatC, é provável que alguma função flagelar seja mantida. Com exceção do fliQ, a falta geral de genes de aptidão associada ao flagelo identificados durante a bacteremia sugere que a importância do tatC para a aptidão de C. freundii pode ser amplamente independente da disfunção flagelar observada nesta cepa.

Vias de aptidão metabólica

Como observado anteriormente, uma porção considerável dos genes de aptidão de Citrobacter identificados foram previstos para funcionar em vias metabólicas (Fig. 2). Três genes diferentes representando componentes do metabolismo central do carbono (pfkA), metabolismo da frutose e manose (mtlD) e biossíntese de aminoácidos (cysE) foram escolhidos para uma investigação mais aprofundada. A biossíntese da cisteína bacteriana ocorre desde a L-serina até a O-acetil-L-serina intermediária (OAS). Esta primeira etapa do modelo E. coli é catalisada pela enzima CysE O-acetiltransferase e a perda da CysE resulta em uma auxotrofia da cisteína38,39. O C. freundii cysE mutante é igualmente incapaz de se replicar em meio definido sem cisteína (Fig. 6A), mas pode atingir densidades próximas à onda quando o meio foi suplementado com OAS (Fig. 6B) ou cisteína (Fig. 6C). A complementação genética da mutação cysE resultou na restauração parcial do crescimento na ausência de cisteína. Curiosamente, a completa falta de crescimento da bactéria mutante cysE na ausência de OAS ou cisteína in vitro está em contraste com o defeito de aptidão parcial observado durante a infecção (Fig. 3A). Isto sugere que o Citrobacter pode ser capaz de obter estes metabolitos a partir do ambiente da corrente sanguínea, mas ainda existe um custo de aptidão física associado à ruptura da via biossintética.

Como parte de nossa investigação sobre o metabolismo associado ao hospedeiro de Citrobacter, a capacidade desta bactéria de utilizar diferentes fontes de carbono foi investigada. A enzima PfkA fosfofrutoquinase de outras espécies entéricas tem sido amplamente caracterizada e representa o primeiro passo comprometido na glicólise, catalisando a fosforilação do fructose-6-fosfato em fructose-1,6-bisfosfato. Para UMH14, a mutação do pfkA eliminou a capacidade desta estirpe de se replicar na glicose como uma única fonte de carbono (Fig. 6D), que poderia ser parcialmente restaurada fornecendo pfkA em um plasmídeo multicópia. Esta perda total de utilização da glicose in vitro correlacionou-se a uma diminuição de duas vezes na aptidão física durante a bacteremia (Fig. 3A). Como a glicose é uma fonte abundante de carbono no soro de mamíferos40, estes resultados são consistentes com o papel da utilização da glicose por Citrobacter durante a infecção, mas também sugerem que o repertório metabólico de Citrobacter pode facilitar a utilização de fontes alternativas de carbono e energia.

Uma segunda atividade enzimática envolvendo fructose-6-fosfato também foi investigada para contribuições à bacteremia por Citrobacter. A proteína MtlD, manitol-1-fosfato-5-de-hidrogenase, facilita a conversão bidirecional de manitol-1-fosfato e fructose-6-fosfato usando NAD+ ou NADH como co-fator41,42. Múltiplas espécies bacterianas entéricas podem utilizar o manitol-1-fosfato de álcool como única fonte de carbono após o transporte através de um sistema fosfo-transferase dependente de hexitol, resultando no acúmulo intracelular de manitol-1-fosfato43,44. Um possível destino do manitol-1-fosfato é a oxidação dependente de MtlD para o fructose-6-fosfato e subseqüente funilagem para a via glicolítica. O mutante C. freundii mtlD apresentou uma diminuição de cinco vezes na aptidão física do fígado murino (Fig. 3A) e esta observação levou a experimentos para determinar se C. freundii era capaz deste tipo de metabolismo in vitro. As cepas UMH14 e derivadas de mtlD foram cultivadas em meio definido contendo manitol e as curvas de crescimento resultantes demonstram que bactérias do tipo selvagem e o mutante complementado foram capazes de proliferar sob essas condições enquanto a cepa mtlD não pôde (Fig. 6E). Como esperado, o mutante mtlD foi capaz de se replicar para níveis próximos aos do tipo selvagem quando fornecido com glicose como fonte de carbono sob condições aeróbicas (Fig. 6F). Juntos estes resultados estabelecem tanto a habilidade de C. freundii em utilizar manitol como uma única fonte de carbono quanto a necessidade de mtlD neste processo.

Estratégias de aptidão física compartilhadas entre patógenos no ambiente da corrente sanguínea

Avaliamos previamente os requisitos de aptidão física de outro patógeno oportunista, S. marcescens, usando um modelo murino similar de bacteremia. Os resultados do estudo de S. marcescens incluíram a identificação de 212 genes de aptidão física usando técnicas similares ao presente trabalho45. Num esforço para determinar se estas espécies compartilham algum caminho comum para a aptidão durante a BSI, os proteomas previstos de ambas as espécies foram comparados pela primeira vez. As proteínas foram consideradas homólogos entre C. freundii e S. marcescens se compartilharam a identidade de aminoácidos ≥50% sobre ≥50% da sequência. No total, 42 proteínas homólogas foram identificadas como fatores significativos de aptidão física em ambos os organismos (Tabela S1) com várias funções diversas estão representadas nesta lista de fatores de aptidão física compartilhados. Notavelmente, a proteína RuvA, cuja perda resultou em uma diminuição >10 vezes na aptidão física de C. freundii por infecção de competição (Fig. 3A), foi identificada juntamente com RuvC como fatores de aptidão física em S. marcescens. Estes resultados apoiam ainda mais a hipótese de que a resolução dos complexos de junção de Holliday, potencialmente durante a reparação recombinacional dos danos de ADN, é importante para a aptidão física in vivo destes organismos. A enzima PfkA phosphofructokinase também foi identificada como um fator de condicionamento físico em ambas as espécies. Como observado com Citrobacter, S. marcescens pfkA é necessária para a utilização da glicose como única fonte de carbono, e foi ainda necessária para a replicação bacteriana ideal em soro humano ativado por calor45. Em ambos os organismos, o S. marcescens pfkA contribuiu para a aptidão física no baço conforme avaliado pela tela de transposição, embora, curiosamente, o mutante S. marcescens pfkA também tenha apresentado cerca de 9 vezes a aptidão física reduzida no rim por infecção de competição com a cepa do tipo selvagem. No decorrer deste trabalho, foi observado que C. freundii UMH14 do tipo selvagem exibiu uma colonização relativamente pobre do rim no modelo BSI, mas o gene pfkA de Proteus mirabilis mostrou contribuir para a aptidão física no rim após infecção do trato urinário46. Juntos, esses resultados demonstram a viabilidade de identificar estratégias de condicionamento físico conservadas entre organismos dentro de um ambiente específico. Será necessário mais trabalho para determinar se esses produtos gênicos também são necessários em organismos adicionais causadores de BSI e se essas vias de condicionamento físico conservadas podem ser exploradas.