Em 4 de dezembro, visitei a Clínica para Crianças Especiais no coração da Pensilvânia, país holandês, onde uma pequena equipe cuida de mais de 2000 pacientes com uma variedade de doenças hereditárias. O posto da semana passada descreveu uma família na qual 5 de 6 crianças têm um distúrbio convulsivo que inclui características autistas. A investigação desta síndrome ao longo dos últimos 15 anos ilustra lindamente a evolução dos métodos de descoberta de genes antes da sequenciação catapultou-nos para uma nova era tecnológica. (Aviso: jargão adiante.)
CONECTING PHENOTYPE TO GENOTYPE
Hoje, para identificar o gene por trás de uma condição não diagnosticada em uma criança, os pesquisadores comparam as seqüências exômicas (parte codificadora de proteínas de um genoma) dos pais e possivelmente dos irmãos para identificar as variantes gênicas causadoras (alelos). É rápido.
Na era pré-genoma, os pesquisadores seguiram uma trajetória indireta para passar do fenótipo ao genótipo:
– Notando que os sintomas “correm nas famílias”
– Encontrando a condição de ser mais comum entre gêmeos idênticos do que entre gêmeos fraternais, e entre irmãos de pacientes do que na população geral.
– Identificando cromossomos anormais em pessoas com a condição.
– Usando estudos de associação de genoma (GWAS) para identificar padrões de variação genética (em conjuntos de locais de base única chamados polimorfismos de nucleotídeos únicos, ou SNPs) que poderiam sinalizar uma variante causadora de doença.
– Identificando o gene e fazendo um modelo de rato para testar tratamentos.
Quando os Amish deixaram a Suíça no início do século XVII para escapar da perseguição religiosa e se estabeleceram na Pensilvânia, eles trouxeram uma amostra do pool genético europeu. A reprodução entre eles amplificou mutações e resultou em “corridas de autozygosidade” em seus genomas – seções de cromossomos que têm as mesmas seqüências de DNA em ambas as cópias. Corridas de autozygosidade indicam que dois parentes herdaram conjuntos de variantes gênicas de um ancestral compartilhado, como primos em segundo grau de um bisavô. Estes alelos, denominados “idênticos por descendência” (BID), constituem uma poderosa ferramenta para a descoberta de genes se aparecerem exclusivamente em pessoas que têm a mesma doença.
A AMISH CONNECTION
O rapaz que conheci na Clínica e 4 dos seus 5 irmãos têm síndrome de epilepsia cortical-focal (CDFE). Ela surge de uma única base de DNA ausente em um gene chamado CNTNAP2.
Como muitos contos da descoberta do gene, a descoberta de que mutações no CNTNAP2 estão por trás de uma variedade de condições cerebrais – autismo, convulsões, esquizofrenia, síndrome de Tourette, e distúrbios da linguagem – começou com diferentes tópicos. Vamos focar na conexão do autismo.
As técnicas genéticas mais antigas demonstram um componente herdado do autismo. Gêmeos idênticos são muito mais propensos a ter ambos do que gêmeos fraternos; irmãos de uma criança com autismo têm um risco 75 vezes maior do que os da população em geral.
Em 1998, o International Molecular Genetic Study of Autism Consortium usou GWAS para identificar 6 regiões do genoma que rastreavam pessoas com autismo – o principal concorrente estava no braço longo do sétimo maior cromossomo, ou “7q.”
Em 1999, pesquisadores implicaram no CASPR2, um tipo de proteína chamada neurexina que, quando anormal, perturba o envio de um impulso nervoso. As neurexinas alinham com outras proteínas chamadas neuroliginas para criar as sinapses que se formam quando uma criança pequena começa a explorar o mundo, consolidando a memória em aprendizagem.
Em 2003 vieram relatos de cromossomos rearranjados que interrompem o gene que codifica CASPR2, CNTNAP2, em pessoas com síndrome de Tourette e em 2007 com pessoas com deficiência intelectual, atraso no desenvolvimento, fala deficiente e hiperatividade, mas não Tourette. Estas diferentes condições não são surpreendentes – os efeitos variam dependendo de onde no cérebro os níveis de neurexina estão desequilibrados.
Em 2006, pesquisadores da Clínica para Crianças Especiais e do Translational Genomics Research Institute combinaram uma mutação na síndrome CNTNAP2 com a síndrome CDFE em crianças Amish estreitamente relacionadas. As convulsões começam por volta da idade em que as características autistas tendem a surgir – 14 a 20 meses.
Antes do início das convulsões, os sintomas de CDFE são sutis: pequenos atrasos motores, reflexos tendinosos profundos pobres e cabeças ligeiramente grandes. As crianças têm dificuldade em se concentrar, imitar as pessoas e planejar movimentos, tais como rastejar, fazer cruzeiros e caminhar. As convulsões são frequentes e graves, e o seu início anuncia o refluxo de habilidades – linguagem, cognitivas e sociais. Após vários anos as convulsões cessam, mas o intelecto permanece em barracas na infância e o indivíduo requer cuidados vitalícios.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, e Holmes Morton, MD, da Clínica e seus colegas usaram dispositivos de microarranjo de 100.000-SNP para analisar o DNA de quatro crianças com síndrome CDFE de três famílias Amish. Eles encontraram uma região autozigótica com 7,1 milhões de bases na área suspeita em 7q. (Hoje os algoritmos detectam rapidamente a autozygosidade em sequências exóticas.)
Os 7,1 milhões de bases incluem 83 genes, mas apenas alguns fazem sentido. A equipe primeiro sequenciou um gene chamado CENTG3 conhecido por causar outros distúrbios cerebrais. Mas as crianças doentes não tinham mutações nele.
Então o Dr. Puffenberger, o geneticista da equipe, encontrou um atalho: ele notou um SNP no meio do CENTG3 que era heterozigoto em duas crianças (duas variantes diferentes), ao invés de homozigoto (a mesma variante em ambas as cópias cromossômicas), marcando um fim para a região idêntica por descendência. “Um evento de recombinação no meio do gene permitiu a Eric se livrar de muito dele para encontrar a mutação. É um exemplo perfeito de ‘o acaso favorece a mente preparada'”, disse-me o Dr. Morton. Essa descoberta cortou a região de interesse em 7q para 3,8 milhões de bases.
O segundo gene candidato, o CNTNAP2, se estende pela região de interesse. A cada criança faltava uma única base em ambas as cópias do cromossoma 7, e cada um dos pais tinha a mesma mutação, mas em apenas uma cópia. Eles são portadores. Foi a primeira lei de Mendel no trabalho.
A equipa tinha encontrado o seu gene. Eles então procuraram mais na comunidade, e entre 105 pessoas Amish saudáveis, quatro eram portadores. Nove dos 18 pacientes que tiveram convulsões parciais mas nenhum diagnóstico específico, de 7 famílias, tinham síndrome CDFE.
As convulsões eram confusas. “Uma mutação pode causar diferentes tipos de convulsões. Quatro crianças de uma família respondem de forma diferente. Algumas são muito deficientes, outras não muito afetadas”, disse o Dr. Morton. Três crianças foram operadas para aliviar as convulsões, mas o alívio não durou muito. No entanto, as cirurgias forneceram amostras de tecido cerebral que permitiram aos pesquisadores descrever melhor o que estava dando errado.
Conectividade no cérebro propenso a convulsões é uma bagunça. Os limites da matéria cinzenta e da matéria branca ficam embaçados, e algumas partes do córtex cerebral ficam espessadas. Os neurónios em si não estão muito bem. Eles são muito redondos, muito apertados, com árvores dendríticas desarranjadas. Pontos nos neurônios indicam muitos núcleos de glia, as células de suporte que compõem a maior parte do sistema nervoso. O relatório da pesquisa de 2006 encerrou poético, descrevendo a amígdala, a sede das emoções, no cérebro epiléptico como “ilhas microscópicas excêntricas de precursores neuronais parcialmente amadurecidos em aglomerados apertados” camuflados em glia run amok.
O retrato do cérebro epiléptico Amish fez sentido à luz do trabalho sobre a proteína neurexina CASPR2 (que significa proteína associada à contactina como 2). A neurexina forma um andaime nos nós de Ranvier. Os nós são os locais expostos em um axônio entre travesseiros de mielina, o material isolante que na verdade é a membrana celular da glia enrolada ao redor do neurônio como um bandaid ao redor de um dedo. Os impulsos nervosos dificultam os nós, enviando mensagens suficientemente rápido para sustentar a vida.
As proteínas CASPR2 nas crianças Amish são atrofiadas. Elas não atravessam as membranas das células neuronais e mergulham no citoplasma como deveriam e, como resultado, os canais de potássio nas proximidades colapsam. Esses canais normalmente permitem que os íons de potássio saiam correndo das células nervosas à medida que um impulso passa, reiniciando o processo. Assim, sem o andaime de neurexina, o neurónio não se pode reiniciar a si próprio. A transmissão pára. E, de alguma forma, as convulsões começam. Acho que não se sabe se as convulsões induzem as características autistas ou se elas surgem diretamente – estudos genéticos adicionais devem indicar que.
A MODELO MOUSE
Daniel Geschwind, MD, PhD e professor de neurologia na Escola de Medicina David Geffen da UCLA, estava trabalhando nos genes do autismo, e leia o artigo de 2006 no New England Journal of Medicine. “Ele ligou e disse, ‘você encontrou o meu gene! Uma boa colaboração começou, e ele fez um rato com a mutação Amish”, disse o Dr. Morton. Os ratos têm o gene CNTNAP2 eliminado, e como as pessoas, eles têm convulsões e características autistas.
“Um rato normalmente corre a gaiola ao redor, normalmente social e tagarela. Esses ratos não eram nenhum dos dois”, explicou o Dr. Morton. Os ratos também apresentavam comportamentos repetitivos e tinham convulsões.
Os cérebros dos ratos mutantes apresentavam um padrão de conectividade anormal, reminiscente do trabalho histológico anterior. “A frente do cérebro fala principalmente consigo mesmo. Ela não se comunica tanto com outras partes do cérebro e não tem conexões de longo alcance com a parte de trás do cérebro”, disse o Dr. Geschwind. O grupo tinha mostrado anormalidades similares no cérebro de crianças com autismo.
A impressionante semelhança entre as crianças Amish e os ratos fornece um campo de teste para drogas. Risperidone, prescrito para tratar comportamentos repetitivos em crianças, teve o mesmo efeito sobre os ratos, ao mesmo tempo em que melhorou a sua capacidade de construção de ninhos. Mas a droga não ajuda as crianças a socializar.
Uma droga candidata óbvia para melhorar as habilidades sociais é a oxitocina “hormônio do amor”. É abundante nos mesmos neurónios do cérebro que são ricos em proteína CASPR2. A oxitocina pode causar características autistas? Os resultados da suplementação da oxitocina são promissores, tanto em ratos como em crianças.
Dr. Geschwind e colaboradores descobriram que um spray nasal de oxitocina “melhora dramaticamente os déficits sociais” nos ratos. Como os ratos não-autisticos não responderam, o hormônio parece realmente compensar um déficit.
Amish farmers already give oxytocin to cows to contract their uterine muscles, and I remember it get it to rev up a stalled labour. Mas não tente isto em casa. Vários ensaios clínicos estão em andamento para oxitocina ou drogas que aumentam sua atividade no cérebro para melhorar a socialização em crianças com autismo.
Autism Speaks financiou o primeiro ensaio clínico de oxitocina em 2010, e o NIH está patrocinando um ensaio maior em andamento de spray nasal de oxitocina. Mas até onde posso dizer, os pacientes foram inscritos com base em diagnósticos clínicos de acordo com o DSM-IV – não o critério mais específico do genótipo.
Embora a idéia de experimentar a oxitocina para melhorar os sintomas sociais no autismo não exigisse conhecer a mutação subjacente, tais informações podem acrescentar precisão a quaisquer conclusões, considerando mecanismos – o que pode levar ao desenvolvimento de outros tratamentos. Em outro post vou ver como a precisão genética permitiu ao Dr. Morton desenvolver curas para certos erros inatos do metabolismo que são muito mais comuns entre os Amish, mas ainda aparecem nas telas de recém-nascidos de todos.