Introdução
Talassemia é a doença sanguínea hereditária mais comum no sudeste asiático e é causada pela síntese reduzida ou ausente das cadeias de globina da hemoglobina (Hb) levando ao desequilíbrio das cadeias de globina.1,2 Beta-talassemia é um dos principais tipos de talassemia e é causada por uma mutação no gene da beta-globina (HBB) no cromossoma 11. O espectro clínico e hematológico da talassemia beta varia de portador silencioso a condições clinicamente manifestadas, incluindo grave transfusão dependente de beta-talassemia major e beta-talassemia intermedia (TI).3,4 Na Tailândia, tanto a beta-talassemia quanto a hemoglobina E (HbE) representam uma das formas mais comuns distribuídas em todas as regiões, especialmente no nordeste da Tailândia. A maioria da talassemia beta severa resulta da interação da talassemia beta e da HbE.5,6
A base molecular da talassemia tem sido estudada mundialmente. Mais de 300 diferentes mutações do gene da beta-globina têm sido caracterizadas. A maioria das mutações beta-talassemia é causada por mutações pontuais, pequenas deleções ou inserções dentro das regiões codificadoras e das junções exon-intrônicas. Os tipos de mutação são tipicamente étnicos.7-9 Na Tailândia, a prevalência de portadores de beta-talassemia varia de 3%-9%.10 Até o momento, mais de 30 mutações diferentes foram identificadas.11-13 A heterogeneidade das mutações torna difícil identificar a mutação em alguns pacientes com beta-talassemia. Várias técnicas de análise de DNA, como a análise ponto blot, ponto blot reverso, amplificação específica de alelo usando sistema de mutação refratária de amplificação (ARMS) ou sequenciamento direto de DNA têm sido amplamente usadas para identificar mutações do gene da beta-globina.14-17
Este estudo visou caracterizar as mutações do gene da beta-globina em 80 pacientes pediátricos portadores de mutações beta-talassemia e que foram acompanhados no Hospital Phramongkutklao, um centro de cuidados terciários para pacientes com talassemia de todas as regiões, especialmente da Tailândia central.
Patientes e métodos
Seleção de pacientes com talassemia
Oitenta pacientes não relacionados à talassemia beta que compareceram à Clínica de Hematologia do Departamento de Pediatria do Hospital Phramongkutklao, Bangkok, Tailândia, no período de janeiro de 2013 a dezembro de 2013, foram inscritos em nosso estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do Hospital Phramongkutklao, Phramongkutklao College of Medicine, Tailândia. Sessenta e cinco pacientes manifestaram clinicamente talassemia beta-talassemia, incluindo 57 com talassemia beta/HbE e oito com homozigotos ou heterozigotos compostos beta-talassemia. Quinze pacientes tiveram talassemia beta-talassemia heterozigótica. Todos os pacientes foram diagnosticados com 18 anos de idade ou menos. Os pacientes com beta-talassemia homozigotos e beta-talassemia/HbE foram classificados clinicamente em T talassemia grave dependente de transfusão maior e TI leve com base em critérios como idade de apresentação, nível médio de Hb no estado estacionário e história de frequência transfusional, conforme descrito anteriormente.18
Análise de mutação
Após a obtenção do consentimento livre e esclarecido, foram coletadas 80 amostras de ácido etilenodiaminotetracético periférico (EDTA) de todos os indivíduos. O DNA genômico foi extraído de linfócitos do sangue periférico usando um kit de minipreparação de DNA genômico do sangue AxyPrep™ de acordo com o protocolo do fabricante. As mutações do gene da beta-globina foram primeiro caracterizadas usando dois conjuntos de reação em cadeia da polimerase específica do alelo (PCR) ou sistema de mutação refratária de amplificação múltipla (M-ARMS) para detectar sete mutações comuns em populações chinesas e do sudeste asiático, incluindo o códon 41/42 (-TCTT), códon 17 (A>T), nucleotídeo -28 (A>G), IVS-II-654 (C>T), códon 71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T) e IVS-I-5 (G>C) como descrito anteriormente.15,17 Estas mutações foram consideradas responsáveis por 80%-90% dos alelos beta-talassemia nesta região.19,20 Genes beta-talassemia desconhecidos foram ainda caracterizados pelo sequenciamento directo do ADN de todas as regiões codificadoras e limites exon-intron para detectar mutações pontuais incomuns e pequenos rearranjos no gene da beta-globina de acordo com protocolos previamente descritos em outras partes.16 Alelos beta-talassemia que permaneceram não caracterizados pelos métodos de M-ARMS e seqüenciamento de DNA acima foram posteriormente rastreados por gap-PCR para detectar deleção de 3,4 kb de todo o gene da beta-globina, previamente relatado em populações tailandesas.21
Resultados
Um total de 88 alelos beta-talassemia de oito pacientes homozigotos ou heterozigotos beta-talassemia composta, 57 pacientes beta-talassemia/HbE, e 15 indivíduos heterozigotos beta-talassemia foram incluídos em nosso estudo. Todos os 80 indivíduos eram de famílias não relacionadas e 93,8% (75/80) dos indivíduos viviam em Bangkok e outras províncias no centro da Tailândia. Destes 65 pacientes que manifestaram clinicamente talassemia beta-talassemia, 92,3% (60/65) e 7,7% (5/65) dos pacientes apresentavam beta-talassemia maior e TI, respectivamente. Nos 60 pacientes beta-talassemia maior, 86,7% (52/60) dos pacientes apresentavam beta-talassemia/HbE enquanto apenas 13,3% (8/60) dos pacientes apresentavam homozigotos ou heterozigotos compostos beta-talassemia. Alternativamente, todos os pacientes com homozigotos ou heterozigotos heterozigotos compostos beta-talassemia e 91,2% (52/57) dos pacientes com beta-talassemia/HbE neste estudo apresentavam graves transfusões dependentes de beta-talassemia maior. Quanto ao genótipo dos pacientes beta-talassemia major, o genótipo mais comum foi o códon 41/42 (-TCTT)/codon 26 (G>A) ou betaE, representando 40%, e o segundo mais comum foi o códon 17 (A>T)/betaE, representando 18.3% de todos os genótipos beta-talassemia maiores (Tabela 1 e Figura 1).
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Tabela 1 Genótipo de 65 pacientes beta-talassemia clinicamente manifestados |
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Figure 1 Tipo de genótipo em pacientes com talassemia beta. |
Para elucidar a base molecular destes 88 alelos beta-talassemia, caracterizamos primeiro o DNA de cada paciente por dois conjuntos de M-ARMS. Setenta e cinco alelos (85,2%) foram identificados por este método, incluindo 33 alelos (37,5%) do códon 41/42 (-TCTT), 23 alelos (26.1%) do códon 17 (A>T), sete alelos (8%) do IVS-I-5 (G>C), seis alelos (6,8%) do IVS-II-654 (C>T), quatro alelos (4,5%) do IVS-I-1 (G>T) e dois alelos (2,3%) do códon 71/72 (+A) (Tabela 2). Curiosamente, o nucleotídeo -28 (A>G) não foi identificado em nosso estudo. Em 13 alelos (14,8%), nenhum dos conjuntos revelou mutação beta-talassemia. Assim, o sequenciamento direto do DNA dos três exons codificadores e junções exon-intrônicos de flanco no gene da beta-globina foi o próximo passo para caracterizar esses 13 alelos. Seis mutações incomuns foram detectadas em nove alelos (10,2%) incluindo quatro alelos (4,5%) do códon 35 (C>A) e um alelo (1,1%) para mutação iniciadora do códon (ATG>AGG), códon 15 (G>A), códon 19 (A>G), códon 27/28 (+C) e códon 123/124/125 (-ACCCCACC), respectivamente (Figura 2). Os alelos restantes, não caracterizados por M-ARMS e sequenciamento de DNA, foram ainda identificados por gap-PCR para detectar deleção de 3,4 kb e esta deleção foi encontrada nos quatro alelos restantes (4,5%).
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Tabela 2 A freqüência de mutações beta-talassemia em 88 alelos |
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Figure 2 Seis mutações invulgares identificadas por sequenciamento directo de ADN. |
No total, 100% dos nossos 88 alelos beta-talassemia foram caracterizados por uma combinação destas técnicas, incluindo dois conjuntos de M-ARMS, sequenciamento directo de ADN e 3,4 kb de detecção de supressão-PCR. Excluindo o gene betaE-globina, 13 diferentes mutações beta-talassemia foram encontradas no presente estudo. A deleção de 4 bp (-TCTT) nos códons 41/42 foi a mutação mais comum identificada em nosso estudo e foi responsável por 37,5% dos alelos. O códon 17 (A>T) foi o segundo mais comum e foi responsável por 26,1% dos alelos. Juntas, essas duas mutações comuns foram responsáveis por mais da metade (63,6%) dos alelos afetados. Todas as outras mutações comuns exceto o nucleotídeo -28 (A>G) representaram 21,6% dos alelos.
Discussão
Este estudo forneceu informações úteis sobre a distribuição de frequência das mutações beta-talassemia entre pacientes pediátricos, especialmente no centro da Tailândia, já que mais de 90% dos pacientes viviam em Bangkok e em outras províncias desta região. No total, 92% das crianças que manifestaram clinicamente talassemia beta-talassemia tinham o fenótipo beta-talassemia maior e mais de 85% dos pacientes pediátricos com beta-talassemia maior tinham beta-talassemia heterozigótica composta e HbE, que é altamente prevalente na Tailândia.5,6,8,10 A frequência do gene da beta-globina E não foi incluída na análise da frequência da mutação beta-talassemia, uma vez que a HbE pode ser facilmente detectada por eletroforese de Hb.
Os métodos transversais podem determinar mutações beta-talassemia.14-17 Este estudo revelou que o M-ARMS detectou sete mutações comuns em populações chinesas e do sudeste asiático e foi capaz de detectar 85,2% dos alelos como em relatórios anteriores.19,20 Como o M-ARMS pode detectar apenas um determinado conjunto de mutações específicas dos primers empregados, o seqüenciamento direto do DNA é o próximo passo para identificar várias mutações pontuais e pequenos rearranjos no gene da beta-globina. Seis mutações menos frequentes foram identificadas em 10,2% dos alelos. A desvantagem do sequenciamento de DNA é que grandes deleções do gene são indetectáveis. Assim, a gap-PCR é o passo final para detectar deleções de 3,4 kb, previamente relatadas em populações tailandesas.21 Uma combinação dessas técnicas poderia identificar mutações beta-talassemia em todos os 88 alelos (100%) de pacientes pediátricos em nosso estudo.
Excluindo o gene beta-globina, 13 diferentes mutações beta-talassemia foram detectadas em 80 pacientes não relacionados. As duas mutações mais comuns detectadas foram o códon 41/42 (-TCTT) e o códon 17 (A>T), responsáveis por 37,5% e 26,1% dos alelos afetados, respectivamente. Todas as outras mutações comuns detectadas por M-ARMS foram responsáveis por 21,6% dos alelos. Em comparação com o estudo anterior das mutações beta-talassemia na Tailândia, isso revelou que a frequência das mutações do gene da beta-globina identificadas em nosso estudo foi diferente. Primeiramente, o nucleotídeo -28 (A>G) não foi identificado em nosso estudo. O nucleotídeo -28 (A>G) é uma mutação beta+talassemia causadora do fenótipo beta-talassemia leve; assim, essa mutação foi observada apenas em pacientes com TI.22 Este presente estudo demonstrou que a TI era o grupo minoritário (menos de 10%) entre os pacientes pediátricos com beta-talassemia sintomática. Isso pode explicar porque essa mutação não foi observada em nosso estudo. Em segundo lugar, a frequência de outras mutações comuns incluindo o códon 41/42 (-TCTT), códon 17 (A>T), IVS-II-654 (C>T), códon 71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T) e IVS-I-5 (G>C) em nosso estudo foi semelhante a outros estudos na Tailândia central.8,10 No entanto, a frequência alélica deste presente estudo foi diferente de estudos em outras partes da Tailândia. O Codon 41/42 (-TCTT) foi a mutação mais comum identificada em nossa população, que vivia principalmente no centro da Tailândia. Essa mutação frameshift é também a mutação mais comum encontrada em outras partes da Tailândia, República Popular da China e Sudeste Asiático.20 Enquanto o códon 17 (A>T) foi o segundo alelo mutado mais comum no centro, norte e nordeste da Tailândia, IVS-I-5 (G>C) foi o segundo mais comum no sul da Tailândia.23 IVS-I-5 (G>C) foi previamente relatado como a mutação mais comum entre pacientes tailandeses muçulmanos no sul da Tailândia.24 Além disso, o códon 71/72 (+A) foi responsável por 2,3% no presente estudo, enquanto essa mutação foi responsável por 6% no norte16 e 13,1% no nordeste13 da Tailândia, indicando uma maior freqüência dessa mutação nessa área.
Seis mutações incomuns incluindo códão 35 (C>A), códão 15 (G>A), códão 19 (A>G) ou Hb Malaio, códão 27/28 (+C), mutação iniciadora do códão (ATG>AGG) e códão 123/124/125 (-ACCCCACC) foram identificadas por seqüenciamento direto de DNA. Embora nenhuma nova mutação tenha sido detectada, duas mutações raras na Tailândia, mutação iniciação do códão e deleção de 8 bp no exon 3, foram encontradas em nosso estudo. A mutação inicial do códon (ATG>AGG) foi descrita pela primeira vez em um paciente chinês com talassemia beta em 1990.25 Na Tailândia, essa mutação foi relatada uma vez em 2005 em dois irmãos com talassemia beta/HbE.26 Embora essa mutação tenha afetado seriamente a síntese em cadeia da beta-globina e muito provavelmente cause o fenótipo beta0-talassemia, todos os três pacientes relatados tinham o fenótipo leve, o que pode ser explicado pela co-inheritância com o genótipo de deleção heterozigótica 3,7 kb alfa-tal-2 entre os pacientes chineses e a associação com o polimorfismo C>T em -158(G)gama-globina nos dois irmãos tailandeses. O fenótipo de nosso paciente era dependente de transfusão beta-talassemia maior, diagnosticada aos 9 meses de idade, enquanto o genótipo era heterozigótico composto entre o códon 41/42 (-TCTT) e a mutação iniciadora do códon. Ambos os alelos mutantes causam o fenótipo beta0-talassemia. A deleção de oito bases no exon 3 ou códon 123/124/125 (-ACCCCACC) foi caracterizada pela primeira vez em crianças do nordeste da Tailândia com o grave fenótipo beta-talassemia/HbE.27 Essa deleção resulta na síntese de 135 aminoácidos da cadeia betaX (beta-Khon Kaen), que são altamente instáveis e degradados logo após a tradução. A alteração extensa de aminoácidos no códon 123 a 131 causou características de inclusão dominante no corpo beta-talassemia como em nosso paciente.
Beta-talassemia/HbE é um grande problema de talassemia na Tailândia e pode ser associado a vários fenótipos clínicos que variam de leves talassemia intermediária a grave talassemia major dependente de transfusão.5,6,8,10 Como em nosso estudo, 85% dos pacientes de beta-talassemia e 100% dos pacientes de TI tinham beta-talassemia heterozigótica composta e HbE. Na beta-talassemia maior, o genótipo mais comum encontrado foi o códon 41/42 (-TCTT)/betaE (40%), seguido pelo códon 17 (A>T)/betaE (18,3%), IVS-I-5 (G>C)/betaE (8,3%) e IVS-II-654 (C>T)/betaE (8,3%), que constituiu 75% de todos os genótipos detectados. Excluindo-se a mutação beta-E-talassemia, todas as mutações beta-talassemia em nossos pacientes sintomáticos foram classificadas como mutação beta0, exceto o códon 19 (A>G) ou Hb Malay, classificado como mutação beta+ e identificado apenas em um paciente.28
Interessantemente, nosso paciente com códon 19 (A>G)/betaE teve manifestação maior da talassemia dependente de transfusão ao invés de TI leve. Por outro lado, heterozigotos compostos entre quatro mutações beta0 incluindo códon 41/42 (-TCTT), códon 17 (A>T), deleção de 3,4 kb, IVSI-1 (G>T) e genótipo betaE manifestado como TI ao invés de beta-talassemia fenótipo maior. Este fenômeno pode ser explicado por vários fatores genéticos e não genéticos, que podem desempenhar papéis na determinação da variabilidade da doença.5,22,29,30 Entretanto, a análise genética adicional (modificadores genéticos) não foi realizada em nosso estudo.
O conceito de diagnóstico genético pré-implantação é permitir a transferência de embriões para o útero em procedimentos de reprodução assistida. Esta técnica é rápida e adequada como ferramenta clínica não invasiva para identificação de doenças genéticas com o objetivo de reduzir abortos seletivos como talassemia maior.31,32 Nosso estudo revelou diferentes mutações beta-talassemia talvez clinicamente aplicadas ao protocolo genético pré-implantatório, permitindo a análise genética molecular para amplificar uma região específica do gene beta-globina para um casal.
Em conclusão, o presente estudo demonstra a heterogeneidade dos defeitos moleculares causadores da beta-talassemia em crianças tailandesas. Todos os alelos beta-talassemia têm sido caracterizados por uma combinação de técnicas incluindo M-ARMS, sequenciamento direto de DNA e gap-PCR para detecção de deleção de 3,4 kb. Treze mutações foram responsáveis por 100% dos genes da beta-talassemia em nosso estudo. A frequência obtida deve representar a frequência de mutações do gene da beta-globina entre pacientes pediátricos, que viviam principalmente no centro da Tailândia.
Acknowledgment
Este estudo foi aprovado e recebeu financiamento da Faculdade de Medicina de Phramongkutklao.
Divulgação
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
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