Amostras FFPE – Preparação de Espécimes de Tecido Humano – Lab-Ally

Tabela de Conteúdos

Introdução |Aquisição de Tecido |Processamento de Tecido FFPE |Seções | Referências

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Introdução

Muitos dos actuais investigadores preferem utilizar amostras de tecidos FFPE para as suas análises IHC, histológicas ou genómicas in situ. FFPE significa “Formalin-Fixeded Parafin-Embedded” e descreve as duas principais características deste método de preservação de tecidos. A formalina é uma solução de formaldeído e está em uso desde a descoberta, no final do século XIX, dos efeitos conservantes do formaldeído pelo médico alemão Ferdinand Blum (Fox, et al., 1985). A parafina é infundida no tecido após a fixação com formaldeído, e o tecido também é envolvido por um invólucro de parafina para ajudar a apoiá-lo e protegê-lo da oxidação. As amostras de FFPE fixadas e embutidas profissionalmente e as biomoléculas que contêm são razoavelmente estáveis à temperatura ambiente. Estruturalmente, os tecidos fixos e embutidos são resistentes e podem ser usados para estudos de anatomia microscópica quase indefinidamente, mas com o tempo, a antigenicidade de algumas proteínas irá degradar, limitando os estudos de IHC a amostras não mais velhas do que algumas décadas. O DNA duplamente encalhado é surpreendentemente estável em blocos de FFPE, mas outras biomoléculas menos estáveis, como o RNA, podem se degradar dentro de uma década ou menos, especialmente uma vez cortadas as seções.

Arquivos que acumulam um grande número de amostras de FFPE são uma fonte de dados especialmente rica quando a comparação de muitos casos (ou seja, amostras de FFPE de vários doadores) é desejável para se tirar conclusões estatisticamente robustas sobre as características de indicações particulares. Se as amostras de FFPE vão ser utilizadas em pesquisas biomédicas “high stakes”, então é importante que cada etapa do processo de preparação seja realizada por profissionais totalmente treinados e certificados, de preferência em um laboratório certificado CLIA (ou seja, inspecionado pelo governo) ou acreditado pelo CAP (College of American Pathologists).

Deve-se notar que o processo FFPE não é universalmente padronizado, e instituições em todo o mundo podem usar protocolos ligeiramente diferentes com diferentes soluções de formalina ou adaptar o processo às suas preferências e exigências. O que se segue é uma visão geral do processo e descrições do que cada passo implica, assim como algumas variações comuns.

Aquisição de Tecidos

O processamento de tecidos é o passo necessário para a aquisição de tecidos. Este é na verdade o elemento mais difícil de controlar porque está entrelaçado com o cuidado do paciente, 41CFR46 complacência, e nos EUA, a supervisão do conselho de revisão interna (IRB). As especificidades do procedimento médico e as convenções dos cuidados padrão são importantes porque podem afetar variáveis como os intervalos de tempo entre a administração da anestesia e a ligadura dos vasos, a remoção do tecido e o tempo decorrido antes da fixação, qualquer um dos quais pode afetar a qualidade do espécime. Por exemplo, é provável que ocorram alterações no RNA e nas proteínas durante o intervalo de tempo, conhecido como tempo de isquemia quente, entre a ligadura do fornecimento de sangue e a remoção de tecido (Dash, et al., 2002). Este tempo de isquemia pode variar de minutos a horas, dependendo do órgão, dos procedimentos operacionais padrão da instituição, do cirurgião e outros profissionais de saúde envolvidos, e da abordagem cirúrgica. Por esse motivo, foi recomendado que esse tempo seja registrado para cada espécime e que seja mantido no mínimo (Hewitt, et al., 2008).

FFPE Processamento Tecidual

Após a amostra tecidual ter sido adquirida, pode ser necessária uma triagem adicional, dissecção ou micro-dissecção (coletivamente referida como grossing) para isolar e preparar a porção específica de tecido que será passada através das demais etapas de processamento. O processamento do tecido hoje em dia é muitas vezes completamente automatizado até à etapa final, a incorporação, que pode ser realizada manualmente. Existem muitos processadores de tecido disponíveis, mas todos seguirão a sequência dos primeiros quatro passos mostrados acima. A automação dos vários passos ajuda a eliminar variações no procedimento como fonte de variação dos resultados experimentais entre diferentes amostras de FFPE.

Fixação

Fixação é o passo inicial no processamento de FFPE. Fatores críticos a serem considerados incluem a solução a ser usada, o tempo permitido para fixação e a espessura e propriedades histológicas da amostra de tecido a ser fixada.

– Solução

O fixador que é usado pela maioria dos laboratórios é neutro-buffered, 10% formalina. A formalina é um líquido de 37-40% de formaldeído e 10% de metanol (por peso) em água; assim, uma solução de 10% de formalina contém cerca de 3,7% – 4% de formaldeído e 1% de metanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). Na realidade, o formaldeído existe em solução principalmente como monômeros ou pequenos polímeros de metilenoglicol (metanodiol, formaldeído monohidratado), que é formado pela reação reversível do formaldeído com água. Os polímeros de metilenoglicol de alto peso são denominados paraformaldeído e precipitarão para fora da solução, mas o metanol retarda este processo de polimerização que é a razão para a sua inclusão em soluções de formalina. Formalina diluída com água (como 10% de formalina) – e especialmente se for uma solução tampão – conterá principalmente monômeros, já que o grande número de moléculas de água quebra qualquer polímero de metilenoglicol que normalmente existiria em uma solução de maior concentração de formaldeído (Kiernan, 2000). Os tampões, o componente restante da formalina, também são adicionados porque o formaldeído tem uma tendência a oxidar o ácido fórmico (Fox, et al., 1985). O ácido fórmico na fixação dos tecidos pode resultar na precipitação de grânulos de pigmento de formalina (hematina ácida) que podem se assemelhar a pigmentos produzidos por alguns parasitas (Pizzolato, 1976). O tamponamento da formalina impede que isto aconteça. Os agentes tamponantes comuns incluem carbonato de magnésio, carbonato de cálcio, citrato, Tris e tampão fosfato (Hewitt, et. al., 2008). A formalina comercial frequentemente contém tampões fosfatados. “Tampão neutro”, que é tipicamente como a formalina é preparada, significa simplesmente que o pH é mantido a cerca de 7,

– Processo e Mecanismo

Por causa do baixo peso molecular do formaldeído e do metilenoglicol, a formalina (principalmente metilenoglicol em solução) penetra nos tecidos relativamente rapidamente, a uma taxa que depende do tipo de tecido, mas com uma taxa média de 1mm/hora (Hewitt, et al., 2008). Os protocolos de fixação variarão, portanto, dependendo do tipo de tecido a ser fixado. Uma vez dentro do tecido, a fração de moléculas de formaldeído que estão presentes na solução começará a se ligar com proteínas, mas isso acontece a uma taxa muito mais lenta do que a taxa de difusão. A reação do formaldeído com o tecido retira-o da solução e reboca a reação reversível do formaldeído para o glicol de volta na direção do formaldeído, de modo que mais dele seja produzido mesmo quando é consumido (Fox, et al., 1985). As cadeias laterais de amino lisina são as mais reativas com o formaldeído, mas outras que são um pouco reativas com o formaldeído incluem arginina, asparagina, histidina, glutamina, serina e tirosina (Howat e Wilson, 2014). Após a reação, o grupo hidroximetil resultante ligado ao complexo pode então reagir com a mesma proteína ou outras proteínas, formando assim pontes estáveis de metileno (proteína-CH2-proteína) (Kiernan, 2000). É isto que produz a insolubilidade e rigidez dos tecidos que foram fixados com formalina e assim preservados. Cerca de 24-48 horas são necessárias para que esta reticulação ocorra suficientemente em todo o tecido (Thavarajah, et al., 2012), mas tem sido recomendado que não sejam permitidas mais de 36 horas para este processo, uma vez que a fixação por um período maior de tempo irá diminuir a qualidade das biomoléculas nas amostras de FFPE, como por exemplo, encurtando o comprimento dos ácidos nucléicos que podem ser extraídos (Hewitt, et al, 2008).

– Limitações

O maior benefício do uso de formaldeído – especialmente como tampão neutro, 10% de formalina – é que ele preserva uma ampla gama de tecidos e componentes. No entanto, ele tem limitações. Por exemplo, uma combinação de formaldeído com glutaraldeído (C5H8O2), ou uma solução de glutaraldeído isoladamente, é tipicamente utilizada para microscopia eletrônica (Kiernan, 2000), pois essas soluções são melhores para a preservação das estruturas teciduais para esse fim. Note que os tecidos preparados com uma solução de glutaraldeído ou glutaraldeído-aldeído não serão considerados amostras de FFPE. Outro desafio é a recuperação de DNA e moléculas de RNA do tecido FFPE como formalina tende a modificar os ácidos nucléicos – a ponto de introduzir mutações artificiais no DNA – e dividi-los em pequenos fragmentos (Srinivasan, Sedmak, e Jewell, 2002). Ainda assim, é possível extrair fragmentos de DNA e RNA do tecido FFPE que são adequados para análise, como descrito em um protocolo escrito por Tang, et al. (2009), sendo um fator chave na recuperação do ácido nucléico a digestão apropriada da protease. Kits comerciais para extração de ácido nucléico de amostras de FFPE também estão disponíveis.

– Espessura do espécime

Um outro ponto importante a considerar em relação à fixação de formalina é a espessura da amostra de tecido. Enquanto a formalina penetra o tecido relativamente rápido, como mencionado acima, a espessura do tecido irá afetar a qualidade da amostra fixa. Será necessário mais tempo para que a formalina alcance o centro das amostras de tecido mais espesso. Enquanto a formalina está gradualmente se difundindo para o interior da amostra, as regiões externas já terão iniciado o processo de fixação, de modo que as biomoléculas que lá se encontram terão maior probabilidade de se degradar no longo período de tempo necessário para a fixação total. Adicionalmente, se os limites de tempo forem cumpridos (como um máximo de 36 horas como mencionado acima), então existe a possibilidade de que a amostra de tecido não seja suficientemente fixada (preservada) na sua totalidade. Por esta razão, tecidos para fixação com largura superior a vários milímetros ou talvez um ou dois centímetros seriam melhor dissecados em segmentos mais finos para uma fixação ótima (Hewitt, et al., 2008). As instituições podem ter diferentes protocolos para o comprimento de tempo e volume de fixador necessário para amostras de tecidos de diferentes larguras, mas em geral a relação entre o volume de fixador e o volume de tecido deve ser de 10:1 (Klatt, 2016).

Desidratação

O segundo passo no processamento de amostras de FFPE é a desidratação. Como a parafina é imiscível com água, toda a água da solução de formalina deve ser removida do tecido antes que a parafina possa infiltrar-se nele. Uma série de soluções com álcool (muitas vezes etanol), frequentemente começando com 70% e progredindo para 100% de álcool, será utilizada para remover essencialmente toda a água do tecido. A utilização de soluções frescas ou a substituição frequente de soluções usadas é necessária para uma desidratação óptima, porque o álcool ficará cada vez mais diluído com o uso. É também imperativo que esta etapa seja completada completamente (com tempo suficiente reservado para esta etapa) porque uma desidratação insuficiente pode levar à degradação do tecido (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Desde que a parafina também não seja miscível em álcoois, a etapa seguinte é remover o álcool com uma substância que seja miscível com a parafina. Este passo é conhecido como clareamento, e o xileno é o agente clareador mais usado (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Infiltração de parafina

Seguindo a fixação, desidratação e clareamento adequados, o tecido pode finalmente sofrer infiltração (ou impregnação) de parafina. Esta etapa também não é padronizada, e instituições de todo o mundo podem usar diferentes parafinas e misturas de ceras de composição variada. As parafinas têm diferentes pontos de fusão e texturas que impactam o bloco tecidual final e suas características. Nos Estados Unidos, bem como na Europa Ocidental, as parafinas sintéticas com baixos pontos de fusão (55°C-63°C) são normalmente utilizadas para os melhores resultados. Látex, dimetil sulfóxido e plastificantes proprietários podem ser incluídos na formulação a fim de modificar a textura e maleabilidade da amostra final do tecido (Hewitt, et al., 2008).

Nations from other parts of the world will often incorporate beeswax into their formulations in order to improve the malleability and decrease the melting temperature of low quality parffins used. A cera de abelha contém contaminantes como o pólen, no entanto, e diminui a qualidade da amostra final. Temperaturas de fusão mais elevadas devem ser evitadas porque mais tarde resultam numa diminuição e insuficiente desparafinização da amostra de tecido, bem como uma diminuição da quantidade de ácidos nucleicos recuperados do tecido (Hewitt, et al., 2008).

Integração de parafina

O último passo no processamento de amostras de FFPE é a incorporação de parafina. A amostra de tecido infiltrado com parafina é rodeada por uma camada de parafina. Deve-se tomar cuidado para orientar corretamente o bloco de tecido no molde (“cassete”), pois isso impacta o plano de secionamento quando as seções finas são cortadas do bloco com um microtomo (Klatt, 2016). Uma vez solidificado o invólucro da parafina, o bloco FFPE está pronto para armazenamento e permanecerá bem conservado por anos, mesmo até décadas (Hewitt, et al., 2008).

Sectioning

Após o tecido estar embutido, ele está pronto para secionar no micrótomo. Como o tecido nem sempre é completamente plano contra a parte frontal da parafina, o histotecnologista tipicamente tem que “enfrentar” o bloco. O bloco de tecido é colocado no suporte do bloco do micrótomo e, enquanto ajusta o ângulo do suporte do bloco de modo a desperdiçar o mínimo possível de tecido, o histotecnologista vira a roda manual, movendo o bloco para cima e para baixo contra uma lâmina afiada. O bloco é cortado até que uma seção representativa completa do tecido esteja na vanguarda do bloco. Uma vez que o tecido é encarado, o bloco é colocado em gelo para esfriar, o que ajudará a facilitar o corte de seções finas; a parafina que está muito quente criará tecido comprimido com seções enrugadas. Quando o bloco é resfriado, ele é colocado de volta no suporte do bloco. O técnico volta a girar o volante, desta vez a um ritmo lento e uniforme para criar secções finas consecutivas que se colam umas às outras, formando uma “fita”.” A fita é colocada num banho de água quente (a temperatura é mantida logo abaixo do ponto de fusão da parafina) para suavizar as rugas que se tenham formado. O técnico coloca então uma lâmina de microscópio no banho-maria e “recolhe” a(s) secção(ões) escolhida(s) de modo a que se colem à lâmina.

A espessura mais comum para secções de tecido é entre 3-5 micrómetros (ou micrómetros, para abreviar), que é a espessura de uma única célula. Lâminas com cortes de 3-5 mícrons são normalmente usadas para coloração, seja a coloração padrão de Hematoxilina & Eosina (H&E), coloração especial, ou coloração imunohistoquímica (IHC). Os pesquisadores frequentemente solicitam “cachos” em vez de cortes finos em lâminas. Os cachos são secções mais espessas (10 microns ou mais) que são colocados em tubos Eppendorf e são geralmente usados sempre que o RNA ou DNA precisa ser extraído das amostras de FFPE. As secções espessas também podem ser colocadas em lâminas em vez de tubos; isto é ideal quando apenas uma porção do tecido será usada para extracção. Neste caso, o tecido é raspado da lâmina e colocado em um tubo. As amostras de FFPE que foram seccionadas são estruturalmente estáveis, e se tratadas e armazenadas adequadamente podem ser usadas para análise microscópica durante algum tempo após a secção ter ocorrido, mas se forem realizadas extracções químicas, então geralmente as secções devem ser usadas o mais rápido possível após o corte para prevenir a degradação oxidativa e biológica das moléculas alvo expostas.

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1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Fixação de Formaldeído. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Mudanças na Expressão Diferencial de Genes devido ao Tempo de Ischemia Quente de Espécimes de Prostatectomia Radical. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Manuseio de Tecidos e Preparação de Espécimes em Patologia Cirúrgica: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Parafin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldeído, formalina, paraformaldeído e glutaraldeído: o que são e o que fazem. Microscopia Hoje, 00(1), 8-12. Obtido de http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Pigmento formalina (hematina ácida) e pigmentos relacionados. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Fixação tecidual e o efeito dos fixadores moleculares nos procedimentos de coloração a jusante. Métodos, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Princípios básicos químicos e físicos da fixação de formaldeído de rotina. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Efeito de Fixadores e Processamento de Tecidos no Conteúdo e Integridade de Ácidos Nucleicos. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). Extracção de ADN do tecido de Formalin-Fixed, Parafina-Embedded. Protocolos do Cold Spring Harbor. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Processamento de Tecido. Faculdade de Medicina da Universidade de Mercer, Savannah. Obtido de http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Acesso em 28 de dezembro de 2016