Albers-Schönberg disease (autossomal dominante osteopetrosis, tipo II) resulta de mutações no gene do canal cloreto ClCN7

Abstract

Albers-Schönberg, ou osteopetrose autossômica dominante, tipo II (ADO II), é a forma mais comum de osteopetrose, um grupo de condições caracterizado por um aumento da massa esquelética devido a reabsorção óssea e cartilagínea deficiente. Após a atribuição do gene causador do ADO II ao cromossomo 16p13.3, relatamos agora sete mutações diferentes no gene que codifica o canal de cloreto ClCN7 em todas as 12 famílias ADO II analisadas. Além disso, um paciente com a forma grave, autossômica recessiva e infantil de osteopetrose (ARO) foi identificado como sendo homozigoto para uma mutação do ClCN7. Das correlações genótipo-fenótipo, parece que o ADO II reflete um efeito negativo dominante, enquanto as mutações por perda de função no ClCN7 não causam anormalidades em indivíduos heterozigotos. Como alguns pacientes ARO têm mutações em ambas as cópias do gene ClCN7, o ADO II é alélico com um subconjunto de casos ARO.

Recebido em 2 de outubro de 2001; Revisado e Aceito em 11 de outubro de 2001.

INTRODUÇÃO

Em saúde, a remodelação do tecido ósseo resulta dos processos equilibrados de formação e reabsorção óssea. A reabsorção excessiva causa osteoporose, que é responsável pela maioria das fraturas não-traumáticas (1). Por outro lado, a reabsorção óssea defeituosa causa osteopetrose caracterizada por ossos densos, mas geralmente frágeis. Pelo menos oito tipos de osteopetrose já foram descritos em humanos (2). A deficiência da isoenzima anidrase carbônica II causa osteopetrose autossômica recessiva (ARO) com acidose tubular renal e calcificações cerebrais (3; MIM 259730), enquanto a maioria dos casos de ARO maligno (4; MIM 259700) reflete mutações no gene TCIRG1 (5,6). Alguns casos raros de osteopetrose, aparentemente com um modo autossômico recessivo de herança, apresentam um fenótipo mais leve e por isso são chamados de forma ‘intermediária’ (7,8; MIM 259710).

A osteopetrose autossômica dominante (ADO) é muito mais comum que suas contrapartidas recessivas (9). No entanto, devido ao seu quadro clínico relativamente benigno, sendo muitos pacientes assintomáticos e detectados apenas por exame radiográfico coincidente, a prevalência de ADO é subestimada. Entre as famílias com ADO, dois subtipos são geralmente relatados com base principalmente nas características radiográficas (10,11). O tipo I (ADOI) apresenta uma osteosclerose generalizada e difusa que afeta especialmente a abóbada craniana (11). O Tipo II (ADO II; MIM 166600), a forma originalmente descrita em 1904 por Albers-Schönberg (12), é a forma mais comum com uma prevalência estimada de até 5,5/100 000 (13). As manifestações clínicas incluem fraturas não-traumáticas, especialmente de ossos longos, paralisia do nervo craniano, osteoartrose do quadril e osteomielite mandibular (14). O ADO II manifesta-se radiograficamente com uma osteosclerose segmentar, predominantemente nas placas terminais vertebrais (“rugger jersey spine”), asas ilíacas (“osso dentro do osso”) e base do crânio (9) (Fig. 1).

Recentemente, uma busca por todo o genoma levou-nos a atribuir um gene subjacente ao ADO II ao cromossomo 16p13.3 (15). Curiosamente, o gene que codifica o canal de cloreto ClCN7 reside na região candidata de 8,4 cM (16). De fato, o canal de cloro é essencial para a acidificação da lacuna de reabsorção extracelular necessária para a degradação do tecido ósseo por osteoclastia (17), sendo mutado em um paciente com ARO (17). Portanto, consideramos o ClCN7 tanto um gene candidato posicional quanto funcional para causar a doença de Albers-Schönberg.

RESULTADOS

Análise da mutação das famílias ADO II

Porque a seqüência genômica incluindo o gene ClCN7 está disponível em bancos de dados de seqüência (GenBank accession nos AL031600 e AL031705), a análise da mutação dos exons e limites intron-exon é possível usando o DNA genômico. Este esforço revelou sete mutações distintas no ClCN7 (Fig. 2) em 12 famílias ADO II não relacionadas (Tabela 1). Cinco mutações são falso senso, uma resulta na deleção de um aminoácido e uma deleta dois nucleotídeos causando uma mudança de estrutura que afeta a extremidade terminal C da proteína. Nenhuma destas mutações foi encontrada em 100 cromossomos de controle.

Quatro mutações são mutações redundantes. A mutação 2423delAG foi identificada em uma família da França e em uma família americana. A mutação G215R ocorreu em uma família francesa, uma dinamarquesa e uma americana. A mutação P249L foi encontrada numa família francesa e numa família alemã. Finalmente, a mutação R767W foi identificada em uma família francesa e americana (Tabela 1). As diferentes origens geográficas das famílias estudadas, assim como a análise dos marcadores de micro-satélite que flanqueiam o gene ClCN7 (dados não mostrados), indicam que estas são mutações independentes, ou seja, não herdadas de um ancestral comum.

Análise da mutação de um paciente ARO

Análise da ligação com marcadores do cromossomo 16p13.3 mostrou claramente a homozigosidade de todos os marcadores em um paciente ARO nascido de pais consanguíneos e saudáveis (dados não mostrados). Portanto, a análise de mutação do ClCN7 foi realizada demonstrando uma mutação homozigótica de falta de sentido na posição 766 (L766P) (Fig. 2). Ambos os pais são heterozigotos para esta mutação.

Posição e conservação dos aminoácidos mutantes

A topologia transmembrana proposta para os canais de cloreto de ClC sugere 10-12 domínios transmembrana (18). Os cinco aminoácidos envolvidos na falta de mutações ADO II, bem como a mutação implicada no paciente ARO, estão todos altamente conservados entre os diferentes membros da família do gene dos canais de cloreto de ClC (Fig. 3). As mutações G215R e P249L são mutações recorrentes encontradas em pacientes de três e duas famílias não relacionadas, respectivamente (Tabela 1). G215 é um resíduo altamente conservado localizado entre D2 e D3 (Fig. 4), uma região conhecida por influenciar as propriedades dos poros dos canais (19), enquanto que P249 participa de um elemento estrutural altamente conservado, formando uma parte substancial do poro do canal de ClC (20). O R286 está localizado no espaço extracelular, mesmo fora do domínio transmembrana D5. Este aminoácido é conservado entre as diferentes proteínas ClC, com excepção do ClC1 e do ClC2 que têm uma sequência divergente nesta região da proteína. As duas mutações ADO II restantes e a mutação ARO estão na parte citosólica, C-terminal da proteína envolvendo os aminoácidos vizinhos. G765, L766 e R767 estão localizados dentro do trecho D13, que coincide com o segundo domínio CBS (cistathionine-β-synthase) descrito na proteína CLCN7 (21). Todas as três mutações se localizam dentro do trecho β2 do domínio CBS, no qual foram relatadas mutações que causaram doenças humanas (22). A função precisa deste domínio ainda não está clara, mas um papel na classificação da proteína foi sugerido (21).

Finalmente, as duas pequenas deleções envolvem aminoácidos da parte terminal intracelular C do ClCN7. Aminoácido L688, deletado em um paciente, está localizado entre os dois domínios CBS, enquanto a deleção de dois nucleotídeos começando na posição de nucleotídeos 2423 resulta, em duas famílias não relacionadas, em uma proteína que difere do tipo selvagem ClCN7 somente nos últimos 10 aminoácidos.

DISCUSSÃO

Osteopetroses em mamíferos compreendem um grupo heterogêneo de condições incluindo pelo menos oito entidades clínicas diferentes em humanos (2) e cerca de nove mutantes animais espontâneos (23). Além disso, modelos nocturnos de camundongos para vários genes causam fenótipos osteopetroticos, ilustrando a diversidade de fatores envolvidos na diferenciação e ativação dos osteoclastos (23).

Recentemente, a heterogeneidade para osteopetroses humanos foi ressaltada pela heterogeneidade genética mesmo dentro do subtipo ADO II (24,25). Esta revelação foi baseada em um estudo de ligação envolvendo uma família dinamarquesa extensa, que atribuiu o gene ADO II ao cromossomo 1p21 (26). Entretanto, essa atribuição não foi confirmada em estudos de outras famílias ADO II. De fato, em nosso recente estudo de ligação, incluindo seis famílias ADO II, localizamos o gene causador da doença no cromossomo 16p13.3 e encontramos na mesma família dinamarquesa a co-regregação entre ADO II e um cromossomo 16p13.3 haplótipo (15). Portanto, especulamos que a evidência de ligação ao cromossomo 1p21 nesta família refletia a co-segregação incidental. No presente estudo, confirmamos esta hipótese identificando uma mutação causadora de doença (G215R) no gene ClCN7 desta família dinamarquesa. Isto, e o fato de que mutações neste gene foram encontradas em todas as 12 famílias ADO II analisadas, sugere que ADO II é geneticamente homogêneo.

Nossos resultados também ilustram que ADO II é alélico com um subconjunto de pacientes com a forma grave, autossômica recessiva, infantil de osteopetrose. Anteriormente, um paciente ARO foi descrito como um heterozigoto composto para uma mutação sem sentido (Q555X) e uma mutação sem sentido (R762Q) no gene ClCN7 (17). Agora encontramos uma mutação homozigota (L766P) em outro paciente ARO.

A Figura 5 ilustra nossa correlação entre os diferentes genótipos e fenótipos. Como demonstrado pelo fenótipo do mouse knockout ClC-7, a perda completa da função do canal de cloreto de ClC-7 causa osteopetrose grave, como visto em pacientes ARO. Como as mutações do ClCN7 têm sido caracterizadas em apenas dois pacientes ARO até o momento, é impossível saber se alguma diferença fenotípica reflete a natureza de suas mutações. Alguns casos raros de osteopetrose têm uma forma “intermediária”. Nesses casos, um modo autossômico recessivo de herança é proposto, mas o fenótipo é mais suave do que no ARO (7,8). Talvez estes casos sejam devidos a combinações de duas mutações no ClCN7 que cada uma só reduz suavemente a capacidade de condutância Cl-.

As mutações ADO II aqui relatadas são principalmente mutações de falta de sentido envolvendo aminoácidos conservados (Figs 3 e 4). As duas mutações restantes são pequenas deleções que também preservam a anatomia principal do canal do cloro, e portanto, muito provavelmente resultam em efeitos comparáveis com as mutações de missense. Como os canais de cloro parecem estar organizados como multimers, provavelmente dímeros (27), essas mutações provavelmente prejudicam sua função devido aos efeitos negativos dominantes. Com tais efeitos, a maioria dos canais de cloro não funcionará, explicando as anormalidades fenotípicas.

Em geral, os pais dos pacientes ARO são fenotípicos normais. Supomos que isso reflete o fato de que a haploinsuficiência desse gene muito provavelmente não causa complicações clínicas ou achados radiográficos. Alternativamente, em alguns casos isso pode ser devido à redução da penetração do ADO II. Os pais do paciente ARO apresentado neste estudo não apresentam nenhum sintoma clínico de ADO II, mas um levantamento radiográfico não estava disponível.

A natureza alélica do ADO II e do ARO é suportada em um relato de uma família extensa que segregou o ADO II no qual um indivíduo manifestou o ARO (28). Talvez nesta família um gene ClCN7 mutado com um efeito negativo dominante cause ADO II que então coincide com uma mutação de novo, ou uma mutação herdada do segundo pai causando ARO. A explicação proposta para as formas dominante e recessiva de osteopetrose associada às mutações do ClCN7 é paralela às mutações do gene ClC-1 que causam a miotonia. Mutações resultando na perda do ClC-1 causam a forma autossômica, recessiva (tipo Becker) (29) enquanto que as mutações de missense se manifestam com a forma menos severa, autossômica dominante (tipo Thomsen) (30).

Em conclusão, mostramos que a maioria, se não todos, os casos de ADO II são causados por mutações no gene ClCN7. Baseado na natureza das mutações do ClCN7, o fenótipo ADO II provavelmente resulta de um efeito negativo dominante. Nossos achados suportam a hipótese de que os canais de cloro geralmente agem como homomultimizadores. Além disso, nosso estudo ilustra a natureza alélica do ADO II e um subconjunto de casos ARO.

MATERIAIS E MÉTODOS

Famílias e pacientes

Famílias A-F foram previamente descritas, pois foram usadas para localizar o gene da doença de Albers-Schönberg no cromossomo 16p13.3 (15). As amostras G-L são de indivíduos afetados de famílias com histórico de doença de Albers-Schönberg e várias também foram descritas (31-33) (Tabela 1).

Família M vive nos Estados Unidos, mas é de ascendência chinesa. A proposita é filho de um casal saudável e nasceu após uma gestação completa. Os pais são primos em segundo grau. A ARO foi diagnosticada aos 3 meses de idade quando ela se apresentou no New York Hospital Medical Center of Queens com paralisia de Bell. O levantamento radiográfico do esqueleto revelou osteopetrose grave e várias fraturas oblíquas não-deslocadas. Ela tinha anemia, reticulocitose, hepatoesplenomegalia e atrofia leve do nervo óptico. A criança foi submetida a um transplante alogênico de medula alogênica, mas morreu aos 18 meses de idade por sepse e insuficiência respiratória.

Análise da mutação

DNA foi isolada do sangue por procedimentos padrão. Primers Intron (Tabela 2), amplificando todos os exons codificadores e limites intron-exon do ClCN7, foram desenhados a partir de sequências genômicas (GenBank accession nos AL031600 e AL031705). Os 25 exons foram amplificados a partir da Taq-polimerase de DNA Genômico ou com sistema amplificador de PCR (Gibco BRL), com concentração de amplificador 1×. Para todas as amplificações, 30 ciclos foram realizados a uma temperatura especificada na Tabela 2.

Os produtos PCR foram purificados com sistema de purificação Concert Rapid PCR (Life Technologies) e sequenciados directamente com os iniciadores usados para amplificação, usando a química do terminador Big-Dye (Perkin-Elmer) num sequenciador automático ABI 3100. A amplificação do exon 9 resultou num fragmento de comprimento variável porque este exon segue uma repetição em tandem de uma sequência de 50 bp com número de cópia variável. Em nosso conjunto de amostras, o número da cópia variou entre quatro e sete repetições. Esta repetição também interfere em algumas amostras com a sequência deste exon na direção direta.

Todos os exons em que mutações putativas foram detectadas, foram sequenciados em 100 cromossomos de controle sem encontrar as mutações.

ACKNOWLEDGEMENTS

Agradecemos aos pacientes e familiares, assim como aos clínicos que forneceram o material. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa (G.0404.00) do ‘Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek’ (FWO) ao W.V.H. Esta pesquisa também foi apoiada por bolsas da ‘Société Française de Rhumatologie’ (SFR), do ‘Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris’ (FERCMHP) e do Shriners Hospital for Children (no. 8540).