Chemicals and reagents
GT zakupiono na rynku w Taichung, Tajwan. IS (czystość 97%) otrzymano z firmy Alfa Aesar (Lancaster, Wielka Brytania). 6,7-dimetoksykumaryna (6,7-DMC, czystość 98%) została dostarczona przez Aldrich Chemical Co. Ltd. (Milwaukee, WI, U.S.A.). EC (czystość 90%), ECG (czystość 98%), EGCG (czystość 95%), kwas mrówkowy, probenecyd, kwas fosforowy (lodowaty, 85%) i metylo-paraben zostały zakupione od Sigma Chemical Co. Ltd. (St. Louis, MO, U.S.A.). EGC (czystość 92,7%) otrzymano z ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). i octan etylu były LC grade i uzyskano je od ECHO Chemical Co. Ltd. (Miaoli Hsien, Tajwan). Acetonitryl był klasy LC/MS i został zakupiony od Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Płodowa surowica bydlęca została uzyskana od Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Izrael). Penicylina-Streptomycyna-Glutamina, Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, trypsyna/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution i kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy zostały zakupione od Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 otrzymano z firmy Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). 6-karboksyfluoresceina została zakupiona od AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.), a 5-karboksyfluoresceinę otrzymano z Acros Organics (Geel, Belgia). Do wszystkich preparatów używano wody Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.).
Przygotowanie i charakterystyka naparu GT
Napar wytwarzano przez namaczanie 2 lub 4 g GT w 50 mL gorącej dejonizowanej wody (98-100 °C) przez 30 min. Napar filtrowano przez gazę, gdy był gorący, aby uzyskać stężenia odpowiednio 40 i 80 mg/ml, które świeżo podano szczurom przez żołądek gavage.
Do charakterystyki naparu GT, po przefiltrowaniu naparu GT z filtrem 0,2 μm RC15 (Sartorious, Goettingen Niemcy), 100 μL filtratu zmieszano z 900 μL metanolu i odwirowano w celu usunięcia osadu. Odpowiednio rozcieńczony przesącz (50 μL) łączono z 50 μL roztworu 6,7-DMC (2,0 μg/mL w metanolu) jako wzorca wewnętrznego, a 5 μL poddawano analizie LC-MS/MS. System HPLC zawierał pompę Accela 1250 i autosampler (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Rozdział chromatograficzny uzyskano przy użyciu kolumny analitycznej Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) z filtrem wstępnym. Faza ruchoma składała się z acetonitrylu zawierającego 0,01% kwasu mrówkowego (A) oraz wody zawierającej 0,01% kwasu mrówkowego (B) i była programowana gradientowo w następujący sposób: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) i 2/98 (12 min). Szybkość przepływu wynosiła 0,2 mL/min. Wyciek z kolumny wykrywano za pomocą sondy H-ESI (heated-electrospray ionization) -II ze spektrometrem mas Quantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Jako gaz osłonowy stosowano azot w ilości 35 jednostek arbitralnych, a jako gaz pomocniczy w ilości 10 jednostek arbitralnych. Energię kolizji ustawiono na -19/18 V, napięcie rozpylania na -3000/3000 V, temperaturę kapilary na 350 °C, temperaturę parownika na 350 °C, a przesunięcie soczewki rurki na -80/88 V. Do analizy monitorowania wybranych reakcji (SRM) wykorzystano następujące przejścia masowe: EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) i 6,7-DMC (207/151). Widma ESI-MS zostały zarejestrowane w trybie jonów ujemnych dla EC, EGC, ECG i EGCG oraz w trybie jonów dodatnich dla 6,7-DMC.
Zwierzęta
Szczury męskie Sprague-Dawley (270-360 g) zostały zakupione z National Laboratory Animal Center (Taipei, Tajwan) i trzymane w warunkach środowiska z 12-h cyklem światło/ciemność. Żywność i woda były nabywane ad libitum do 12 h przed eksperymentami. Szczury zostały podzielone na dwie grupy. W pierwszym eksperymencie wykorzystano 28 szczurów w celu określenia wpływu GT na poziom IS i PCS w surowicy szczurów CRF; w drugim eksperymencie wykorzystano 14 szczurów w celu oceny wpływu GT na czynność nerek szczurów CRF. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w ścisłej zgodności z zaleceniami ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” opublikowanymi przez Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. Protokół eksperymentalny został przejrzany i zatwierdzony w dniu 08/01/2014 (numer zezwolenia: 103-126-N) przez Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Utworzenie modelu CRF i podawanie infuzji GT
CRF wywołano poprzez doustne podanie adeniny zgodnie z wcześniejszymi badaniami, ale z pewną modyfikacją19,23,35,36. Krótko mówiąc, adeninę zawieszoną w 0,5% metylocelulozie 400 (15 mg/ml) podawano doustnie 28 szczurom przez zgłębnik żołądkowy dwa razy dziennie przez siedem kolejnych dawek (15 mg/rat) przez cały okres eksperymentalny. W 4. dniu oznaczono stężenie IS w surowicy. Po potwierdzeniu osłabienia funkcji nerek przez znaczne podwyższenie poziomu IS w surowicy, szczury CRF podzielono na trzy grupy (8-10 szczurów w każdej grupie) z porównywalnym poziomem IS. Pierwsza grupa otrzymała 400 mg/5 mL/kg GT w infuzji dwa razy dziennie przez siedem kolejnych dawek; druga grupa otrzymała 200 mg/5 mL/kg GT dwa razy dziennie przez siedem kolejnych dawek; a trzecia grupa otrzymała równolegle 5 mL/kg wody jako kontrolę. W dniu 8. szczurom podano 7. dawkę GT o godzinie 9:00 rano po całonocnym poście, a próbki krwi pobierano w 0, 15, 30, 60, 120, 180 i 360 min po podaniu dawki. Planowany czas pobierania krwi i podawania adeniny i GT podsumowano na ryc. 3. W każdym momencie pobierania próbek, w znieczuleniu izofluranowym, pobierano 0,5 mL krwi. Próbki krwi zebrano w mikrotubkach i odwirowywano przy 10 000 g przez 15 minut, aby uzyskać surowicę, która była przechowywana w temperaturze -20 ° C przed analizą.
Określenie stężeń IS i PCS w surowicy
Do określenia stężeń IS i PCS w surowicy, 50 μL próbki surowicy wymieszano za pomocą worteksu z 200 μL metanolu zawierającego odpowiednio 10 μg/mL 6,7-DMC lub 100 μg/mL metyloparabenu jako wzorców wewnętrznych i odwirowano w celu usunięcia osadu, a następnie 20 μL podwielokrotność poddano analizie HPLC.
W celu przygotowania kalibratora, 50 μL surowicy dodawano serię stężeń IS i PCS, aby uzyskać zakresy stężeń odpowiednio 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) i 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM). Późniejsza procedura była zgodna z tą opisaną powyżej dla próbek surowicy. Krzywe kalibracyjne zostały wykreślone przez regresję liniową stosunku powierzchni piku (IS lub PCS do wzorca wewnętrznego) względem znanych stężeń IS i PCS, odpowiednio.
Aparatura HPLC zawierała pompę (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japonia), detektor fluorescencyjny (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japonia) i automatyczny wtryskiwacz (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japonia). Kolumna Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) została wyposażona w kolumnę ochronną (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokio, Japonia). Faza ruchoma składała się z acetonitrylu (A)-0,1% kwasu fosforowego (B) i była programowana w sposób gradientowy w następujący sposób: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) i 15/85 (24-35 min) dla IS oraz 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) i 16/84 (24-36 min) dla PCS. Ustawienia detektora były następujące: Ex 280 nm/Em 375 nm dla IS i Ex 214 nm/Em 306 nm dla PCS. Szybkość przepływu wynosiła 1,0 mL/min.
Wpływ GT na Cr i BUN u szczurów z CRF
W innym doświadczeniu zastosowano ten sam protokół dla zwierząt, o którym mowa powyżej, i oznaczono stężenia Cr i BUN przed leczeniem adeniną (dzień 0), przed podaniem GT (dzień 4) i po 7. dawce GT (dzień 8). Po potwierdzeniu osłabienia funkcji nerek przez znaczne podwyższenie Cr i BUN w dniu 4, szczury CRF zostały podzielone na dwie grupy (7 szczurów w grupie) o porównywalnych poziomach Cr. Pierwsza grupa otrzymywała 400 mg/5 mL/kg GT dwa razy dziennie przez siedem kolejnych dawek; druga grupa otrzymywała równolegle 5 mL/kg wody jako kontrolę. W 8. dniu podawano szczurom 7. dawkę GT i wodę po całonocnym poście, a próbki krwi pobierano 30 min później. Cr oznaczano metodą kinetyczną pikrynianu alkalicznego w aparacie ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN oznaczano za pomocą reakcji sprzężonej ureaza/dehydrogenaza glutaminianowa przy użyciu tego samego analizatora.
Linia komórkowa i warunki hodowli
Konstrukcja trwale transfekowanych linii komórkowych używanych do badań transportowych, komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) wyrażających hOAT1 (CHO-hOAT1), komórek ludzkiej zarodkowej nerki 293 (HEK) wyrażających hOAT3 (HEK-hOAT3) i odpowiadających im linii komórkowych kontrolnych transfekowanych pustym wektorem, została opisana wcześniej40,41. Komórki CHO utrzymywano w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w podłożu DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) zawierającym 10% surowicy, 1% penicyliny/streptomycyny i 1 mg/mL G418. Komórki HEK były utrzymywane w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w podłożu DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) zawierającym 10% surowicy, 1% penicyliny/streptomycyny i 50 μg/mL higromycyny B. Komórki hodowano w szalkach pokrytych poli-D-lizyną.
Przygotowanie i charakterystyka metabolitów surowicy GT (GTM)
W celu naśladowania cząsteczek oddziałujących z OAT in vivo, GTM przygotowano od szczurów i scharakteryzowano. W skrócie, infuzję GT (800 mg/10 mL/kg) podawano doustnie szczurom na czczo przez noc. Krew pobierano po 15 min od podania wlewu GT. Po koagulacji zebrano surowicę, którą wirowano z 3-krotnym dodatkiem metanolu. Po odwirowaniu przy 10 000 g przez 15 min, supernatant zagęszczono w wyparce rotacyjnej pod próżnią do sucha. Do pozostałości dodano odpowiednią ilość wody, uzyskując roztwór o 10-krotnym stężeniu surowicy, który podzielono na podwielokrotności i przechowywano w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
Porcję GTM scharakteryzowano zgodnie z wcześniejszą metodą z pewnymi modyfikacjami16,46. Krótko mówiąc, 100 μL próbki surowicy zmieszano z 50 μL sulfatazy (zawierającej 1000 jednostek/ml sulfatazy i 39,861 jednostek/ml ß-glukuronidazy), 50 μL kwasu askorbinowego (200 mg/mL) i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 45 min w warunkach beztlenowych. Po hydrolizie surowicę dodano do 50 μL 0,1 N HCl, a następnie rozdzielono 250 μL octanu etylu (zawierającego 100 ng/mL 6,7-DMC jako wzorzec wewnętrzny). Warstwa octanu etylu została odparowana pod N2 do sucha i odtworzona z odpowiednią objętością fazy ruchomej przed analizą LC-MS/MS. Faza ruchoma składała się z acetonitrylu (A) – wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego (B) i była programowana gradientowo w następujący sposób: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) i 2/98 (12 min). Szybkość przepływu wynosiła 0,2 mL/min.
Wpływ GTM na transport wychwytu mediowany przez hOAT1 i hOAT3
Komórki HEK-hOAT1 i HEK-hOAT3 (1 × 105 komórek/basenik) hodowano na płytkach 96-dołkowych. 6-karboksyfluoresceina (6-CF) i 5-karboksyfluoresceina (5-CF) zostały użyte jako sondy do oceny wpływu GTM na aktywność hOAT1 i hOAT3, odpowiednio47,48. Dodatkowo, probenecid (80 μM) został użyty jako kontrola pozytywna dla inhibicji hOAT1 i hOAT349. Po 24 h lub 48 h inkubacji CHO-hOAT1 lub HEK-hOAT3, pożywkę usuwano i przemywano trzykrotnie buforem PBS. Przed eksperymentem transportowym, komórki CHO-hOAT1 i HEK-hOAT3 były preinkubowane z badanymi czynnikami (GTM i probenecyd) w temperaturze 37 °C. Po 30 min inkubacji dodawano 6-CF lub 5-CF i inkubowano odpowiednio przez kolejne 5 min i 10 min. Płytki natychmiast umieszczano na łaźni lodowej, usuwano supernatanty i trzykrotnie przemywano komórki lodowatym PBS. Następnie dodawano 100 μL 0,1% Triton X-100 w celu zlizywania komórek i mierzono fluorescencję przy wzbudzeniu przy 485 nm i emisji przy 528 nm. Aby określić ilościowo zawartość białka w każdej studzience, 10 μL lizatu komórkowego dodawano do 200 μL rozcieńczonego odczynnika do oznaczania białka (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) i mierzono gęstość optyczną przy 570 nm. Względną wewnątrzkomórkową akumulację 6-CF lub 5-CF obliczono przez porównanie z kontrolą po korekcji białek.
Analiza danych
Szczytowe stężenie w surowicy (Cmax) uzyskano na podstawie obserwacji doświadczalnych. Pole powierzchni pod krzywą stężenie w surowicy – czas (AUC0-t) obliczono przy użyciu reguły trapezowej do ostatniego punktu. Różnice IS i PCS między trzema grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, natomiast różnice Cr i BUN między dwiema grupami analizowano za pomocą niesparowanego testu t-Studenta, przyjmując p < 0,05 jako poziom istotny. Niesparowany test t-Studenta zastosowano również do analizy wyników badań in vitro.