Abstract
Xiao-Yao-San (XYS) decoction is a traditional Chinese medicine formula. Badanie to miało na celu zbadanie wpływu XYS na zdolności poznawcze i mechanizm leżący u jego podstaw u szczurów poddanych ovariectomii. Samice szczurów Sprague-Dawley poddano owariektomii i podawano im XYS (3 g/kg lub 9 g/kg) przez zgłębnik, z podskórnym wstrzyknięciem 17-β estradiolu (E2, 2 μg/kg) jako pozytywnej kontroli leku i zgłębnikiem 1 ml soli fizjologicznej (0,9%) jako kontroli placebo. Po 6 tygodniach leczenia szczury badano za pomocą testu labiryntu wodnego Morrisa. Poziom estradiolu w surowicy i hipokampie był mierzony metodą ELISA. Barwienie Golgiego przeprowadzono w celu obserwacji morfologii neuronów w hipokampie. Apoptozę komórek hipokampa obserwowano za pomocą barwienia TUNEL. Zawartość białka receptora N-metylo-D-asparaginianowego (NMDAR) 2A i 2B w regionie CA1 hipokampa określono metodą Western blot i immunohistochemii. Ekspresję receptora estrogenowego (ER) i sygnalizacji PI3K wykryto metodą Western blot. W porównaniu z grupą sham, zarówno uczenie się jak i pamięć były upośledzone u szczurów poddanych ovariektomii. Szczury, którym podawano E2 lub duże dawki XYS wykazywały lepszą zdolność uczenia się i zapamiętywania w porównaniu do szczurów, którym podawano sól fizjologiczną. Wysoka dawka XYS znacząco zmniejszyła opóźnienie ucieczki w próbie akwizycji przestrzennej; w międzyczasie, czasy krzyżowania i czas trwania w kwadrancie sondy były zwiększone w próbie sondy przestrzennej. Wysoka dawka XYS promowała syntezę de novo zawartości E2 w hipokampie, ale nie miała znaczącego wpływu na poziom E2 w surowicy. Barwienie Golgiego wykazało, że wysoka dawka XYS może zwiększyć liczbę rozgałęzień i gęstość spinek dendrytycznych w obszarze CA1 hipokampa. Barwienie TUNEL wykazało, że wysoka dawka XYS łagodziła indukowaną ovariektomią apoptozę neuronów. Poziom ekspresji NMDAR2A i NMDAR2B w hipokampie CA1 został podniesiony przez leczenie XYS. Korzystne działanie XYS odbywało się poprzez aktywację sygnalizacji ERα-PI3K. Podsumowując, leczenie wysoką dawką XYS może poprawić zdolności poznawcze szczurów poddanych ovariektomii poprzez ochronę neuronów hipokampa i przywrócenie hipokampalnego poziomu E2.
1. Wprowadzenie
Perimenopauzalne kobiety często cierpią z powodu lęku i depresji związanych z wahaniami poziomu estrogenów. Oprócz lęku i depresji, zapominalstwo jest kolejnym częstym problemem u kobiet w okresie okołomenopauzalnym. Badanie Seattle Midlife Women’s Health Study wykazało, że 60% kobiet w średnim wieku zauważyło pogorszenie pamięci. Badanie SWAN (Study of Women’s Health Across the Nation) wykazało, że okres okołomenopauzalny był zależnym czynnikiem ryzyka dla zgłaszanego przez siebie zapominania u kobiet w średnim wieku. Ponieważ mózg jest ważnym celem regulacji estrogenowej, spekuluje się, że to właśnie niedobór estrogenów może być odpowiedzialny za pogorszenie funkcji poznawczych. Jednak wyniki badań obserwacyjnych dotyczących wpływu estrogenów na procesy poznawcze nie są w pełni spójne. Co więcej, skuteczne terapeutyczne interwencje hormonalne poprawiające sprawność poznawczą nie zostały jeszcze ustalone. Co więcej, inne czynniki, takie jak postrzegany stres, nastrój i zdrowie fizyczne, mogą również przyczyniać się do objawów pamięci. Produkcja estrogenów w jajnikach jest bardziej prawdopodobne, aby wpłynąć na pamięć w przypadku gwałtownego spadku, a nie naturalnego przejścia . W przeciwieństwie do niespójności w badaniach na ludziach, ustalenia w ovariectomized zwierząt wsparcia stowarzyszenia niedoboru estrogenów ze zmianami poznawczymi i skuteczności hormonalnej terapii zastępczej .
Suplementacja z fitoestrogenów jest popularna terapia alternatywna w celu złagodzenia objawów menopauzy. Fitoestrogeny, takie jak flawonoidy, izoflawony i lignany, mają strukturę podobną do estrogenów steroidowych i mogą odgrywać rolę estrogenopodobną poprzez aktywację receptorów estrogenowych (ERs). Metaanaliza potwierdziła skuteczność suplementacji izoflawonami sojowymi w poprawie pamięci wzrokowej u zdrowych kobiet po menopauzie. Badanie SWAN Phytoestrogen Ancillary Study wykazało, że wysokie spożycie izoflawonów lub lignin może poprawić szybkość przetwarzania lub pamięć werbalną na pewnym etapie menopauzy, chociaż korzyści były również związane z pochodzeniem etnicznym/rasą. Wpływ fitoestrogenów na poprawę zdolności poznawczych jest wyraźniej zaznaczony w badaniach na zwierzętach. Wyciąg hydroalkoholowy z nasion kozieradki może złagodzić ovariectomy- (OVX-) wywołane uszkodzenie neuronów hipokampa i poprawić uczenie się i wydajność pamięci w modelu szczura .
Xiao-Yao-San (XYS), co oznacza szczęśliwy i beztroski proszek w języku chińskim, jest tradycyjną formułą medycyny chińskiej (TCM), która jest stosowana w leczeniu lęku menopauzalnego i depresji. Formuła składa się z Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe) i Glycyrrhizae radix (Gancao). Systematyczna analiza obejmująca 26 randomizowanych badań wykazała, że XYS była lepsza od leków przeciwdepresyjnych, na co wskazywały wyniki skali depresji Hamiltona i mogła zwiększyć skuteczność leków przeciwdepresyjnych w poprawie wyników skali samooceny depresji. Kobiety w okresie okołomenopauzalnym z wytrzeszczem oczu i kołataniem serca mogą również odnieść korzyści z leczenia XYS. Niektóre działania terapeutyczne XYS w łagodzeniu zespołu menopauzalnego mogą być przypisane obecności fitoestrogenów. Wiele badań wykazało obecność fitoestrogenów w XYS. Ergosterol znajduje się w Poria cocos (Fuling), a β-sitosterol jest znany z obecności w Angelicae radix (Danggui). Miller-Marini i wsp. opracowali test estrogen-chimeryczny receptor/Gal4-response element regulated/luciferase-reporter do wykrywania obecności fitoestrogenów w złożonych formułach TCM. Przeanalizowali Bupleurum & Peony Formula, zmodyfikowaną formułę XYS z tymi samymi głównymi ziołami i znaleźli mierzalną zawartość fitoestrogenów. Obecność fitoestrogenów w XYS sugeruje, że XYS ma potencjał do leczenia zaburzeń poznawczych spowodowanych niedoborem estrogenów. Badanie na zwierzętach wykazało, że XYS może osłabić przewlekły stres związany z unieruchomieniem (CIS), wywołany deficytem uczenia się i pamięci. Obecnie, żadne badanie nie oceniało wpływu XYS na poprawę zaburzeń poznawczych u kobiet w okresie okołomenopauzalnym. W związku z tym, w obecnej pracy badano wpływ XYS na zdolności poznawcze i mechanizm leżący u jego podstaw u szczurów OVX.
2. Materiały i Metody
2.1. Zwierzęta i leczenie
W sumie w tym badaniu użyto 60 samic szczurów Sprague-Dawley. Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyczną Zwierząt Doświadczalnych (numer zatwierdzenia: ACU170802). Zwierzęta były trzymane w domu z wolnym dostępem do wody i standardowej diety w warunkach kontrolowanej temperatury i wilgotności. Szczury zostały losowo podzielone na 5 grup (12 szczurów/grupa): grupa sham, OVX + sól fizjologiczna lub grupa O-solina, OVX + 17-β estradiol (E2) lub grupa O-E2, OVX + XYS 9 g/kg lub grupa O-XYS9 oraz OVX + XYS 3 g/kg lub grupa O-XYS3. Szczury poddano operacji OVX w znieczuleniu, jak opisano wcześniej. W skrócie, podłużne nacięcie zostało wykonane w jednej trzeciej części tułowia i 1-2 cm od każdej strony kręgosłupa. Tkanka tłuszczowa została delikatnie wyciągnięta pęsetą. Zidentyfikowano jajnik i podwiązano rogi macicy. Jajnik został usunięty, a nacięcie brzucha zostało zaszyte. W grupie pozorowanej, brzuch nacięto bez OVX.
Terapię rozpoczęto dwa tygodnie po operacji OVX i trwała ona przez sześć tygodni. Szczury w grupach leczonych XYS otrzymywały XYS przez igłę gavage w pojedynczej dawce dziennej 9 g/kg lub 3 g/kg. Podskórne wstrzyknięcie E2 (2 μg/kg) ustawiono jako pozytywną kontrolę lekową. Podanie 1 ml soli fizjologicznej (0,9%) stanowiło kontrolę placebo. Odwar XYS stosowano w postaci ekstraktu (1 g/ml, co odpowiada 1 g surowego zioła/ml), który został dostarczony przez Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. Formuła odwaru XYS została podana z wyprzedzeniem. Dawka XYS stosowana w klinice dla kobiet w okresie okołomenopauzalnym wynosi 175 g surowego zioła/60 kg, co odpowiada 3,5 g/kg u szczurów. Nawiązując do innych doniesień doświadczalnych na modelu szczurzym, ustaliliśmy dawkę niską na poziomie 3 g/kg, a dawkę wysoką na poziomie 9 g/kg . Proszek E2 (nr kat. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) rozpuszczono w niewielkiej ilości etanolu, a następnie przygotowano 20 μg/ml roztwór podstawowy z 0,9% solą fizjologiczną.
2.2. Morris Water Maze Test
Funkcję uczenia się i pamięci u szczurów oceniano za pomocą testu labiryntu wodnego Morrisa (MWM) . Urządzenie do eksperymentu MWM to okrągły basen (o średnicy 200 cm) z wodą o wysokości 38-40 cm. Temperatura wody utrzymywana jest na stałym poziomie 20-22°C. Test MWM składa się z trzech części, a mianowicie z próby akwizycji przestrzennej (trwającej 5 dni), próby sondy przestrzennej oraz próby widocznej platformy. W próbie akwizycji przestrzennej szczury były delikatnie umieszczane w losowym kwadrancie zbiornika wodnego z platformą ukrytą 1,5 cm w kwadrancie północno-wschodnim pod wodą. Każdemu szczurowi pozwalano pływać do 60 sekund w celu odnalezienia platformy. Szczury, którym nie udało się znaleźć platformy w ciągu 60 s, były na nią naprowadzane, a opóźnienie ucieczki było rejestrowane jako 60 s. Opóźnienie ucieczki było rejestrowane przez system analizy wideo (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). Szczury były trenowane 4 razy dziennie. Po 5 dniach treningu, szczury otrzymywały próbę sondy przestrzennej z platformą usuniętą z północno-wschodniego kwadrantu. Szczury umieszczono w tym samym miejscu startowym w kwadrancie północno-zachodnim. Rejestrowano ślady przemieszczania się szczurów poszukujących platformy w czasie 120 s. Czas trwania i czasy przejścia w kwadrancie docelowym były obliczane w celu oceny retencji pamięci przestrzennej. Następnego dnia po próbie z sondą przestrzenną, szczury otrzymywały próbę z widoczną platformą, podobną do próby z ukrytą platformą, w której platforma była podniesiona 1,5 cm nad powierzchnię wody i umieszczona w kwadrancie południowo-zachodnim. Każdy szczur był wypuszczany 4 razy, za każdym razem z innego punktu wejścia. Rejestrowano opóźnienie ucieczki, dystans pływania i prędkość pływania.
2.3. Pobieranie próbek
Po zakończeniu testu MWM, szczury poddano torakotomii i zaintubowano do aorty wstępującej przez lewą komorę w znieczuleniu pentobarbitalem sodowym (40 mg/kg we wstrzyknięciu dootrzewnowym). Krew z pnia pobierano przy użyciu probówki z separatorem surowicy do wykrywania E2. Hipokampy od sześciu szczurów zostały oddzielone od kory mózgowej i otaczających tkanek mózgowych, szybko usunięte, przemyte zimnym PBS i zamrożone w ciekłym azocie do wykrywania E2 i Western blot. Trzy nieperfuzjowane tkanki mózgowe unieruchomiono w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny i użyto do barwienia Golgiego i immunohistochemii. Lewe trzy szczury były perfundowane przezskórnie zimną solą fizjologiczną, a następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez 1 h. Mózgi były następnie usuwane, utrwalane w 4% paraformaldehydzie przez 24 h i osadzane w parafinie do barwienia TUNEL.
2.4. Wykrywanie E2
Próbki krwi pozostawiono do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej i odwirowywano przez 15 minut w temperaturze 4°C w celu oddzielenia surowicy. Tkanki hipokampa ważono, homogenizowano w zimnym roztworze soli fizjologicznej i odwirowywano przez 20 min w celu zebrania supernatantu. Zawartość E2 w surowicy i supernatancie homogenatu hipokampa wykryto za pomocą zestawu ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China).
2.5. Barwienie Golgiego
Hipokamp został pocięty na małe bloki i przetworzony do barwienia Golgiego, jak opisano . Krótko mówiąc, bloki hipokampa były zanurzone w roztworze barwiącym Golgiego (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Chiny) przez 14 dni, podczas których roztwór barwnika był wymieniany co 2-3 dni. Tkanki odwadniano 30% sacharozą i wykonywano sekcje o grubości 100 μm. Sekcje poddawano dehydratacji etanolowej, klarowano ksylenem i montowano na szkiełkach powlekanych żelatyną. Barwienie Golgiego przeprowadzono z powodzeniem we wszystkich próbkach. Morfologia neuronów w hipokampie była obserwowana w mikroskopie świetlnym (Nikon, Tokyo, Japonia). Neurony w regionie CA1 hipokampa były analizowane przy użyciu wtyczki Neuron J w oprogramowaniu Image J. Dla każdego szczura wybrano pięć sekcji, a spiny dendrytyczne o kompletnej morfologii zostały wybrane dla każdej sekcji. Gęstość i punkty rozgałęzień spinek dendrytycznych zostały zmierzone.
2.6. Immunohistochemia
Ekspresję podjednostek 2A i 2B receptora N-metylo-D-asparaginianowego (NMDAR) w hipokampie określono metodą immunohistochemii zgodnie ze standardową procedurą. Użyto pierwotnych przeciwciał króliczych anty-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Chiny) i króliczych anty-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Chiny). Przeciwciałem wtórnym było HRP-koniugowane anty królicze IgG (Servicebio).
2.7. Barwienie TUNEL
Zmiany morfologiczne w hipokampie były wykrywane przez barwienie TUNEL przy użyciu komercyjnego zestawu (Roche, Mannheim, Niemcy) zgodnie z instrukcją. Wycinki poddano reakcji kolorymetrycznej DAB, a następnie barwieniu hematoksyliną. Jądra komórek apoptotycznych TUNEL-pozytywnych były brązowe w mikroskopie świetlnym. Dla każdego szczura wybierano pięć wycinków i dla każdego wycinka wybierano trzy nie powtarzalne pola (powiększenie 400x). Obliczono odsetek komórek TUNEL-pozytywnych we wszystkich komórkach.
2.8. Western Blot
Część mózgu hipokampa CA1 została szybko wyekstrahowana i pocięta na małe sekcje zgodnie z atlasem mózgu. Tkanki hipokampa inkubowano przez noc z buforem lizującym RIPA (zawierającym 100 Mm PMSF, zakupionym w firmie Servicebio). Szczątki komórkowe usuwano przez wirowanie przez 10 min, aby zebrać supernatant zawierający białko. Stężenie białka oznaczano przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Lizaty białkowe (30 μg/lane) rozdzielano za pomocą 10% SDS-PAGE i elektroblotowano na membranę PVDF. Po zablokowaniu 5% mlekiem beztłuszczowym, membrana była sondowana przez noc następującymi przeciwciałami pierwotnymi: królik anty-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), królik anty-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), królik anty-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), królik anty-ERα (1 : 2000, Millipore), królicze anty-fosfo-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), królicze anty-fosfatydyloinozytol 3-kinazy (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), królicze anty-Bax (1 : 1000, Abcam), królicze anty-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam) i królicze anty-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH był wykrywany jako kontrola wewnętrzna. Następnie membranę sondowano drugorzędową peroksydazą chrzanową (HRP-) sprzężoną z kozią IgG anty-rabbitową (1 : 5000, Bioworld) przez 1,5 h. Paski wizualizowano metodą chemiluminescencji. Średnią gęstość optyczną pasm białkowych określano ilościowo za pomocą oprogramowania Image J.
2.9. Analiza statystyczna
Dane doświadczalne analizowano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). Dane liczbowe zostały wyrażone jako średnia ± SD. Różnice między dwiema grupami porównywano testem t. Wyniki prób z ukrytą platformą analizowano metodą ANOVA z powtarzanymi działaniami grupa × dzień, a następnie post hoc Tukeya. Other multiple comparisons were analysed by one-way ANOVA followed by Tukey’s post hoc. value < 0.05 was considered statistically significant.
3. Results
3.1. Xiao-Yao-San Decoction Improves Spatial Learning and Memory Abilities of Ovariectomized Rats
Zdolność uczenia się oceniano najpierw za pomocą próby akwizycji przestrzennej. Powtórzona ANOVA wykazała, że zarówno leczenie jak i dni treningowe miały wpływ na opóźnienie ucieczki (Rysunek 1(a)). Latencja ucieczki we wszystkich grupach zmniejszała się wraz ze wzrostem liczby dni treningowych (), a różnica była również znacząca w trendzie spadku latencji w każdej grupie (). Nie było interakcji między leczeniem a dniami szkolenia (). Podczas pierwszych dwóch dni szkolenia nie zaobserwowano istotnej różnicy w latencji ucieczki w każdej grupie. Od trzeciego dnia szkolenia, latencja ucieczki była znacząco dłuższa niż w grupie pozorowanej; latencja ucieczki w grupie E2 i wysokiej dawki XYS9 była krótsza niż w grupie soli fizjologicznej, ale nie różniła się od grupy pozorowanej. Po 5 dniach treningu, szczury zostały ocenione za pomocą próby sondy, aby przetestować pamięć przestrzenną. Jak pokazano na rycinie 1(b), czasy krzyżowania, czas trwania i procent czasu trwania w kwadrancie sondy były znacząco zmniejszone w grupie z solą fizjologiczną. Nie zaobserwowano różnicy w czasie trwania w innych kwadrantach. Leczenie XYS lub E2 mogło znacząco przywrócić czasy krzyżowe i czas trwania w kwadrancie sondy do poziomu z grupy sham. W celu wykluczenia wpływu czynników środowiskowych oraz poziomu poznawczego i aktywności zwierząt doświadczalnych na uczenie się i pamięć przestrzenną, szczury poddano również próbie widocznej platformy (rysunek 1(c)). Nie zaobserwowano istotnych różnic w opóźnieniu ucieczki, dystansie pływania i prędkości pływania pomiędzy grupami. Łącznie, wyniki te sugerują, że uczenie się i pamięć przestrzenna były upośledzone u szczurów OVX, a leczenie wysoką dawką XYS może skutecznie poprawić upośledzone funkcje poznawcze.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.2. Xiao-Yao-San Decoction Increases Hippocampal Estrogen Content in Ovariectomized Rats
Następnie, badaliśmy wpływ XYS na poziom estrogenu u szczurów OVX. Jak pokazano na rycinie 2(a), leczenie XYS nie poprawiło poziomu estradiolu w surowicy krwi obniżonego z powodu OVX; jednakże nie było znaczącej różnicy w poziomie estradiolu w surowicy krwi między grupami leczenia sham i OVX. Należy zauważyć, że wysokie dawki XYS i E2 zwiększyły poziom estradiolu w hipokampie w porównaniu z roztworem soli fizjologicznej (Figura 2(b)). Grupa O-XYS3 nadal miała niższy poziom estradiolu w hipokampie niż grupa sham. Zmiana zawartości E2 w hipokampie może nie być wyjaśniona przez zmianę zawartości E2 pochodzącej z gonad, ale przez zmianę syntezy in situ. Dlatego też wykryliśmy ekspresję CYP19, końcowego enzymu w syntezie estrogenów, w hipokampie. Wyniki wykazały, że leczenie XYS lub E2 mogło zwiększyć ekspresję CYP19 w porównaniu z grupą soli fizjologicznej (), ale tylko różnica między grupą XYS w dużej dawce i grupą soli fizjologicznej była znacząca (). Leczenie nie przywróciło poziomu CYP19 do tego z grupy sham. Wyniki sugerują, że XYS promował ekspresję aromatazy w hipokampie, zwiększając w ten sposób syntezę de novo E2.
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
3.3. Xiao-Yao-San Decoction Reduces Neuronal Damage in the Hippocampus of Ovariectomized Rats
Morfologia komórek w hipokampie, zwłaszcza w regionie CA1, odgrywa ważną rolę w zdolnościach poznawczych. Morfologia komórek w hipokampie została przeanalizowana przez barwienie Golgiego, jak pokazano na ryc. 3(a). W porównaniu z grupą sham, liczba neuronów w grupie soli fizjologicznej znacznie się zmniejszyła, a morfologia kolców dendrytycznych została uszkodzona. Dalsza analiza neuronów CA1 wykazała, że punktowa liczba neuronów i gęstość spinek dendrytycznych znacznie się zmniejszyła w grupie otrzymującej sól fizjologiczną (ryc. 3(b) i 3(c)). Leczenie wysoką dawką XYS zwiększyło liczbę neuronów w hipokampie oraz podniosło punktową liczbę neuronów i gęstość spine’ów w regionie CA1. Leczenie E2 miało taki sam efekt terapeutyczny jak wysokodawkowa XYS. Jednak niska dawka XYS nie poprawiła skutecznie uszkodzenia neuronów w regionie CA1 hipokampa. Konsekwentnie, apoptoza neuronów hipokampa (CA1, CA3, DG) została zmniejszona przez wysoką dawkę XYS lub leczenie E2 (Figura 4). Jednakże, niska dawka XYS mogła jedynie zmniejszyć apoptozę neuronów CA3, ale nie miała wpływu na neurony CA1 i DG. Podsumowując, wysoka dawka XYS może zmniejszyć uszkodzenie neuronów w hipokampie, szczególnie w regionie CA1.
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(a)
(b)
Wywar Xiao-Yao-San zwiększa hipokampalną ekspresję NMDAR2A i NMDAR2B u szczurów ovariectomizowanych.
Plastyczność synaptyczna jest neurobiologiczną podstawą długotrwałego uczenia się i pamięci, a wydajność w teście MWM jest pod wpływem funkcji NMDAR . Dlatego dalej ocenialiśmy ekspresję podjednostek NMDAR 2A i 2B w hipokampalnym CA1. Western blot (ryc. 5(a) i 5(b)) wykazał, że ekspresja NMDAR2A i NMDAR2B była zmniejszona u szczurów OVX. Leczenie XYS lub E2 znacząco zwiększyło poziom ekspresji tych dwóch białek do tego samego poziomu, co w grupie sham. Immunohistochemia (Figura 5(c)) również wykazała, że odsetek pozytywnie wybarwionych komórek wzrósł w grupach poddanych leczeniu. W porównaniu z grupą soli fizjologicznej, wysoka dawka XYS znacząco zwiększyła ekspresję zarówno NMDAR2A jak i NDMAR2B ( i 0,013, resp.), ale niska dawka XYS mogła tylko znacząco zwiększyć ekspresję NMDAR2A ().
(a)
(b)
(c)
.
(a)
(b)
(c)
3.4. Xiao-Yao-San Decoction Activates PI3K Signaling Pathway through ERα
Wpływ E2 lub fitoestrogenów na fizjologię jest mediowany przez sygnalizację ER. Badania wykazały, że aktywacja kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), kinazy białkowej aktywowanej mitogenem, jest konieczna dla korzystnego wpływu E2 na pamięć. Fosforylacja ERK1/2 jest zależna od aktywacji PI3K. Dlatego zbadaliśmy wpływ XYS na sygnalizację ER-PI3K. Jak pokazano na rycinie 6, wysokie dawki XYS i E2 znacząco promowały ekspresję ERα, fosforylowanego ERα (Ser118) i PI3K p110β (podjednostka katalityczna) w porównaniu z grupą soli fizjologicznej. Aktywacja ERα-PI3K dodatkowo zmniejszała ekspresję proapoptotycznego czynnika Bax i zwiększała ekspresję antyapoptotycznego czynnika Bcl-2. Niska dawka XYS nie wpłynęła jednak istotnie na sygnalizację ERα-PI3K, co jest zgodne z wynikami rycin 3 i 4.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4. Dyskusja
XYS od dawna jest stosowany w leczeniu lęku i depresji okresu okołomenopauzalnego. W naszym badaniu badaliśmy nowe zastosowanie XYS w leczeniu zaburzeń poznawczych wywołanych przez OVX. Wyniki wykazały, że XYS skutecznie poprawił uczenie się przestrzenne i pamięć przestrzenną u szczurów OVX. Możliwym mechanizmem jest to, że XYS promuje syntezę de novo estrogenów w hipokampie, aktywując w ten sposób szlak sygnałowy ERα-PI3K i hamując apoptozę neuronów hipokampa.
Mechanizm działania XYS w leczeniu depresji był szeroko badany. XYS odgrywa rolę przeciwdepresyjną poprzez regulację kompleksowej sieci obejmującej neuroprzekaźniki, neurotrofiny, oś podwzgórze-przysadka-nadnercza, aminokwasy i lipidy. Niektóre z tych badań wykazały, że XYS może działać na zmiany w mózgu związane ze stresem. Badania in vitro wykazały, że surowica zawierająca XYS może odwrócić zmiany w potencjale błony mitochondrialnej, stężeniu wolnego wapnia i tempie apoptotycznym neuronów wywołanym przez stres oksydacyjny. Nasze badania wykazały, że XYS również osłabił apoptozę neuronów w rejonie hipokampa u szczurów OVX. Antyapoptotyczne efekty XYS sugerują, że ma on potencjał działania na różne procesy patologiczne związane z apoptozą neuronów w mózgu.
Wyniki naszego badania wykazały, że XYS może przywrócić poziom estrogenu w hipokampie szczurów OVX. Hipokamp jest niezbędny do tworzenia pamięci i jest bogaty w ERs, a estrogen ułatwia wyższe poznawcze i synaptyczne zdrowie poprzez te ERs . Kilka badań klinicznych wskazało na skuteczność hormonalnej terapii zastępczej na objawy poznawcze związane z utratą estrogenów u kobiet. XYS mógł zwiększyć poziom estradiolu w hipokampie, co powinno być kluczową podstawą jego skuteczności w poprawie zdolności poznawczych u szczurów OVX. Jednakże XYS nie podnosił poziomu estradiolu w surowicy. Może to wynikać z faktu, że estradiol może być syntetyzowany de novo w hipokampie, podczas gdy estradiol w surowicy pochodzi z gonad. Nasze wyniki wykazały, że XYS zwiększał ekspresję CYP19 w hipokampie, sugerując, że zwiększona ilość E2 w mózgu prawdopodobnie pochodziła z hipokampa. Wyniki naszego badania wykazały, że XYS zwiększał ekspresję NMDAR2A i NMDAR2B w hipokampie szczurów OVX. Odkrycie to było zgodne z wcześniejszymi badaniami. Stwierdzono, że estrogen zwiększa zarówno gęstość spinek dendrytycznych jak i liczbę synaps w hipokampie poprzez modulację funkcji NMDAR u szczurów OVX. Estrogen może również przywrócić morfologię neuronów hipokampa u starych szczurów poprzez przywrócenie poziomu NMDAR2B do poziomu obserwowanego u młodych szczurów w regionie CA1; co więcej, estrogen może wpływać na mobilność NMDAR2A i NMDAR2B w obrębie synapsy. Aktywacja NMDAR z kolei może przyczynić się do syntezy hipokampalnej E2 poprzez indukowanie napływu Ca2+ .
Oprócz NMDARs, XYS może regulować ekspresję innych czynników związanych z poznaniem w mózgu. Utrata białka gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95), synaptofizyny i czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) w hipokampie została bezpośrednio skorelowana z deficytami uczenia się i pamięci. Działanie XYS u szczurów z CIS było związane z promowaniem ekspresji PSD-95 i synaptofizyny w hipokampie. Wykazano również, że XYS podnosi poziom BDNF w korze czołowej, regionie CA1 hipokampa i migdałkach szczurów z CIS. Podczas procesu leczenia CIS z XYS, szlak sygnałowy kinazy c-Jun N-końcowej (JNK) został zahamowany w hipokampie .
Ale nie zbadaliśmy konkretnie, który składnik jest głównym aktywnym XYS na uczenie się i pamięć, nasze wyniki sugerują, że głównym źródłem fitoestrogenów w XYS jest kandydat wart dalszych badań. Badania nad antydepresantami mogą również dostarczyć nam pewnych wskazówek. Jiali Liu et al. odkryli, że Bupleuri radix (Chaihu) jest głównym lekiem przeciwdepresyjnym w recepcie XYS w oparciu o analizę farmakochemiczną frakcji eteru naftowego. Badania in vitro wykazały, że ekstrakt z Bupleuri radix promował proliferację komórek neuroblastoma poprzez aktywację ścieżki PI3K/AKt. Aktywacja PI3K była również obserwowana w naszych badaniach. .
Obecne doniesienia kliniczne wskazują, że XYS ma znaczący antydepresyjny efekt terapeutyczny, ale nie ma jasnych badań toksykologicznych dotyczących toksyczności i skutków ubocznych XYS w szczegółach. Ogólnie rzecz biorąc, XYS może być traktowany jako lek na receptę bez zbyt wielu skutków ubocznych. XYS posiada kilka zmodyfikowanych receptur, których podstawowe składniki są takie same jak XYS. W niedawno przeprowadzonej metaanalizie oceniono skuteczność i bezpieczeństwo stosowania zmodyfikowanego XYS w leczeniu zespołu okołomenopauzalnego. Zbiorcze wyniki sugerują, że zmodyfikowany XYS może być skuteczniejszy i bezpieczniejszy w leczeniu zespołu okołomenopauzalnego w porównaniu z hormonalną terapią zastępczą. Jednakże, ze względu na słabą metodologię włączonych badań, skuteczność i bezpieczeństwo XYS wymagają bardziej rygorystycznych badań w celu ich potwierdzenia. Wykorzystując metodę magnetycznego rezonansu jądrowego 1H (NMR), grupa badawcza Xiaoxia Gao podała, że frakcja eteru naftowego zawierająca składniki lipofilowe była najbardziej skuteczną frakcją w leczeniu depresji. Stwierdzono również, że Bupleuri Radix, główny składnik antydepresyjny, może powodować więcej efektów toksycznych w wątrobie lub nerkach zdrowych szczurów niż u szczurów z przewlekłym nieprzewidywalnym łagodnym stresem. Efekty toksyczne były związane ze zwiększonym stężeniem kwasów żółciowych, ułatwieniem degradacji lizyny i zaburzeniami metabolizmu sfingolipidów, glicerofosfolipidów i kwasów tłuszczowych. Wynik ten został potwierdzony w niedawnym badaniu metabolomicznym pacjentów z depresją. XYS odgrywał rolę przeciwdepresyjną poprzez regulację syntezy leucyny, waliny i izoleucyny oraz metabolizmu kwasu dwuskładnikowego, kwasu tłuszczowego, arginy i proliny. Badania te sugerują, że konieczne jest ścisłe monitorowanie stanu pacjenta z terminowym dostosowaniem dawki leku, aby zapobiec toksycznym działaniom niepożądanym.
5. Wnioski
W tym badaniu wykazaliśmy, że leczenie wysoką dawką XYS miało podobną skuteczność jak E2 w poprawie zdolności poznawczych szczurów OVX. Efekt terapeutyczny był uwarunkowany ochroną neuronów hipokampa i przywróceniem hipokampalnego poziomu E2. W procesie tym brał udział szlak sygnałowy ERα-PI3K. Nasze badanie sugeruje, że XYS może być opcją w leczeniu okołomenopauzalnych zaburzeń poznawczych. Obecnie XYS jest stosowany głównie w leczeniu lęku klinicznego i depresji. Potrzeba więcej danych klinicznych, aby zweryfikować jego wpływ na poprawę funkcji poznawczych.
Dostępność danych
Dane wykorzystane do poparcia wyników tego badania są dostępne na życzenie u odpowiednich autorów.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów w żadnej formie.
Wkład autorów
Lina Liu i Fei Ge w równym stopniu przyczynili się do tego badania.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez National Natural Science Foundation of China (Grant nos. 81603578, 81503536, 81673795, and 81903974); Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant no. BK20181235); Jiangsu Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine (Grant no. YB2017066); the Nanjing Science and Technology Development Plan Project (Grant no. 201715072); Projekt Szpitala Medycyny Chińskiej Prowincji Jiangsu (Grant nr Y2018CX09); oraz Projekt finansowany przez Priorytetowy Rozwój Programu Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu.