W tym badaniu postawiliśmy hipotezę, że różne metody izolacji RNA będą miały wpływ na wyniki podczas analizy ekspresji genów w tkankach. Metody ekstrakcji RNA można ogólnie scharakteryzować jako ekstrakcję fenol:chloroform, po której następuje wytrącenie alkoholem (TRIzol), fenol:chloroform, po której następuje ekstrakcja w fazie stałej (kolumnowa; miRVana i miRNeasy) oraz separacja w fazie stałej z/bez żywicy powinowactwa (Norgen total i Isolate II). Metodologie te zostały opracowane głównie do ekstrakcji długich mRNA i opierają się na założeniu, że wszystkie RNA są oczyszczane w równym stopniu. Ponadto, istnieje szereg czynników decydujących o wyborze konkretnej metody ekstrakcji RNA, takich jak jakość, ilość, cena i łatwość użycia (czas do ekstrakcji). W tym miejscu przedstawiamy dane, które pokazują, że metoda używana do ekstrakcji RNA będzie również dawać zmienne wyniki w porównaniu z różnymi metodami w dalszych zastosowaniach i dlatego jest kolejnym ważnym czynnikiem.
To badanie pokazuje, że metody izolacji RNA różnią się pod względem ilości i jakości próbek RNA oraz w analizie ekspresji miRNA i genów docelowych. Wybraliśmy narządy, z których izolacja RNA może być trudna z różnych powodów. Na przykład, izolacja RNA z mózgu często skutkuje niską wydajnością z powodu wysokiej zawartości lipidów. Było to szczególnie widoczne w przypadku zestawu Bioline Isolate II. Protokół producenta sugeruje, że do 5 μg RNA powinno być oczyszczone z 10 mg mózgu szczura/myszy. Jednakże, podręcznik miRNeasy sugeruje, że 5-20 μg RNA powinno być osiągalne z mózgu przy tej samej ilości materiału wejściowego. Rozwiązywanie problemów na stronie producenta opisuje jeden problem z tkankami bogatymi w lipidy – zatykanie się kolumny i sugeruje zmniejszenie ilości próbki lub zwiększenie objętości buforu lizującego. Nasze ekstrakcje zostały wykonane w sugerowanych granicach protokołu. Następnie sugerują wykonanie ekstrakcji wstępnej przy użyciu odczynnika TRIsure (odpowiednik TRIzol firmy Bioline), a następnie separację na kolumnach za pomocą zestawu do oczyszczania fazy wodnej. Ta metoda byłaby wtedy porównywalna z metodami ekstrakcji RNA miRVana i miRNeasy i może skutkować lepszą wydajnością dla tej tkanki. Dodatkowo, jakość RNA koreluje ze specyficznymi dla danej tkanki odpowiedziami na stres fizjologiczny zarówno przed, jak i po śmierci tkanki. Tkanki takie jak płuco i wątroba charakteryzują się niskim RIN i małym pikiem 28S, ponieważ tkanki te są podatne na szybszą degradację RNA przez wysoki poziom nukleaz. W celu inaktywacji nukleaz tkanka jest szybko zamrażana, a rozmrażanie jest uniemożliwiane do momentu dodania zważonego materiału do buforu ekstrakcyjnego. Chociaż rozmrożeniu tkanki zapobieżono, nie możemy wykluczyć, że czas od eutanazji zwierzęcia i wycięcia narządów do szybkiego zamrożenia jest czynnikiem przyczyniającym się do ogólnie niskich wartości RIN i niektórych produktów degradacji obserwowanych we wszystkich próbkach płuc, niezależnie od użytego zestawu do izolacji. Alternatywną metodą inaktywacji nukleaz jest zastosowanie roztworu stabilizującego RNA, takiego jak RNAlater (ThermoFisher Scientific), który umożliwia późniejsze przetwarzanie niezamrożonych próbek tkanek. Może on pomóc w zapewnieniu integralności RNA, ale nie jest zgodny ze wszystkimi procedurami izolacji RNA i użytkownicy powinni sprawdzić swoją konkretną metodę przed wykonaniem ekstrakcji. Dodanie piku po 60 s w niektórych próbkach w analizie Bioanalizatora sugeruje zanieczyszczenie gDNA. Dodatkowa obróbka DNazą może być przeprowadzona na kolumnach z niektórymi zestawami, jednakże etap eliminacji gDNA jest wysoce zalecany podczas etapu odwrotnej transkrypcji. Włączenie tego kroku do naszych metod może wyjaśniać, dlaczego nie było zakłóceń podczas analizy ekspresji mRNA w próbkach płuc Norgen, ale miało to wpływ na analizę ekspresji miRNA, ponieważ protokół testu Taqman miRNA nie obejmuje usuwania gDNA. Ponadto, czystość próbek RNA jest czynnikiem krytycznym, ponieważ chociaż próbki o RIN > 7 powinny działać dobrze w większości dalszych zastosowań, te, które obejmują reakcje enzymatyczne, takie jak qPCR, mogą być hamowane przez nukleazy, jony metali lub zanieczyszczenia organiczne. Ogólnie rzecz biorąc, próbki RNA z Izolatu II Bioline miały niższy stosunek 260/230 i zanieczyszczenia mogły przyczynić się do ich gorszej wydajności. Wreszcie, zaobserwowano różnice we wzbogacaniu dla miRNA w preparacie całkowitego RNA. Ponieważ miRNA stanowią niewielką frakcję całkowitego repertuaru RNA, określenie ich udziału w analizie integralności może być trudne. Test Qubit microRNA oferuje wysoce selektywne wykrywanie małych ilości małych RNA, nawet w obecności typowych zanieczyszczeń. Wysoki odsetek miRNA był powszechnie wykrywany przy użyciu metod ekstrakcji miRVana i Norgen, jednak biorąc pod uwagę analizę integralności dla preparatów Norgen całkowitego RNA, możliwe jest, że wzbogacenie miRNA może być przeszacowane, ponieważ mniejsze fragmenty RNA są wykrywane w następstwie degradacji lub utleniania większych RNA (mRNA, rRNA lub tRNA) lub w przypadku próbek płuc zanieczyszczenie DNA zakłóca wyniki Qubit. Dlatego też ilość, jakość i czystość próbek RNA są bardzo ważnymi czynnikami przy wyborze konkretnej metody ekstrakcji RNA, a dalsze badania nad tym, jak zoptymalizować te metody dla interesującej nas tkanki, mogą pomóc w ich poprawie.
Profilowanie miRNA może dać wgląd jako biomarkery do zastosowań diagnostycznych lub prognostycznych. Na przykład, panele miRNA mogą być wykorzystywane do klasyfikacji różnych fenotypów nowotworów, przewidywania nawrotów lub odpowiedzi na terapie. Jednakże, w celu odkrycia i klinicznego zastosowania biomarkerów opartych na miRNA, konieczne są zoptymalizowane i znormalizowane praktyki dotyczące sposobu ekstrakcji RNA, aby zapobiec sprzecznym wynikom. Na przykład metaanaliza 63 opublikowanych badań przeprowadzona przez Zhou i wsp. (2014) wykazała niespójne, a nawet sprzeczne wyniki przy ocenie wartości prognostycznej onkomiR, miR-21 . Autorzy przypisują heterogenność różnicom w źródle próbek, metodach detekcji i metodach normalizacji, ale nie nawiązali do metod ekstrakcji RNA, które, jak wykazujemy, również się do tego przyczyniają.
Funkcje biologiczne i cele bardzo niewielu miRNA zostały doświadczalnie zwalidowane, ale jest to krytyczne dla wykorzystania potencjału terapii opartej na miRNA. Ponadto, odkrycie specyficznych dla danej tkanki funkcji biologicznych pomoże określić ich działanie terapeutyczne i potencjalne efekty uboczne w normalnych tkankach. Walidację interakcji miRNA-mRNA przeprowadza się głównie w hodowlach komórkowych, które wymagają sztucznej manipulacji endogennymi miRNA. Jednakże, poziomy osiągane poprzez manipulacje w hodowlach komórkowych (np. transfekcja mimetyków) nie są zwykle na fizjologicznym poziomie obserwowanym in vivo, dlatego ważne jest, aby zrekapitulować wyniki w odpowiednich modelach zwierzęcych. Obecnie nie ma doniesień bezpośrednio porównujących detekcję miRNA i genów docelowych z próbek całkowitego RNA przy użyciu różnych metod ekstrakcji. Pokazujemy, że metody ekstrakcji RNA różnią się skutecznością w izolowaniu zarówno krótkiego jak i długiego RNA, dlatego należy dokładnie rozważyć wybór odpowiedniej metody, jeśli chce się wykryć oba z tej samej próbki.
Wcześniejsze badania powszechnie zakładały, że wszystkie rodzaje RNA są oczyszczane w równym stopniu. Pojawiło się jednak kilka doniesień wskazujących na różnice w wydajności ekstrakcji w zależności od metody zastosowanej do izolacji RNA. Kim i wsp. (2011) wycofali swoją pracę w Molecular Cell, ponieważ odkryli, że ich wnioski dotyczące różnic w ekspresji miRNA z komórek hodowanych przy różnej gęstości (wysoka gęstość vs. niska gęstość) i kiedy były odłączone od naczynia hodowlanego (przylegające vs. zawiesina) były w rzeczywistości wyjaśnione przez różnice w wydajności ekstrakcji RNA przy użyciu metody TRIzol. Stwierdzili oni, że miRNA o niskiej zawartości GC i stabilnej strukturze drugorzędowej były tracone podczas ekstrakcji, a nie degradowane w komórkach, jak początkowo opublikowali. Wcześniejsze wyniki El-Khoury i wsp. (2016) znaleźli różnice w odzyskiwaniu miRNA z komórek, osocza i egzosomów pochodzących z moczu/osocza przy porównaniu zestawów do ekstrakcji TRIzol LS, miRNeasy serum/plasma i miRCURY biofluid . Autorzy stwierdzili, że zestaw miRCURY izolował RNA o wysokiej czystości, ale słabo odzyskiwał miRNA, TRIzol dawał RNA o niskiej czystości, co wpływało na wydajność PCR, podczas gdy miRNeasy dawał RNA o niskiej jakości, ale najlepiej nadawał się do wykrywania miRNA. Podobnie McAlexander i wsp. (2013) stwierdzili różnice w ekstrakcji miRNA z osocza i płynu mózgowo-rdzeniowego . Porównali ekstrakcje miRVana, miRCURY Cell and Plant kit oraz TRIzol LS z i bez glikogenu jako nośnika. miRVana była podobna z lub bez glikogenu, podczas gdy miRCURY bez glikogenu miała nieco niższy odzysk miRNA niż miRVana. Jednakże, glikogen znacznie poprawił odzysk miRNA za pomocą zestawu miRCURY, ale pogorszył niską wydajność i zmienność ekstrakcji TRIzolem. Następnie porównano zestaw miRCURY Cell and Plant z metodami miRCURY Biofluids i miRNeasy do ekstrakcji surowicy/osocza z glikogenem jako nośnikiem i stwierdzono, że miRCURY Biofluids charakteryzował się najwyższą względną liczebnością wprowadzonego egzogennego miRNA i stwierdzono, że jest to lepsza metoda dla ich konkretnego zastosowania. Łącznie, badania te podkreślają różnice w odzyskiwaniu RNA przy użyciu różnych metod ekstrakcji i sugerują potrzebę optymalizacji dla komórki, tkanki i/lub płynu będącego przedmiotem zainteresowania.
Jest kilka etapów podczas przepływu pracy, które mogą wprowadzić zmienność eksperymentalną. Począwszy od metody utrwalania lub zamrażania tkanki, przechowywania materiału, metody ekstrakcji RNA, metody stosowanej do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji qPCR lub innych platform downstream. W tym badaniu staraliśmy się kontrolować niektóre z tych zmiennych poprzez błyskawiczne zamrażanie tkanek, przechowywanie w temperaturze – 80 °C, zapobieganie rozmrażaniu przed ekstrakcją i stosowanie najbardziej zalecanych praktyk do analizy ekspresji miRNA. Na przykład, użycie primerów RT specyficznych dla sekwencji w przeciwieństwie do uniwersalnego primera RT okazało się lepsze dla specyficznej amplifikacji produktu. qPCR jest uważany za złoty standard dla analizy ekspresji miRNA i celu ze względu na jego czułość i specyficzność w stosunku do globalnych platform profilowania. Co ważne, jakość uzyskanych wyników jest ważniejsza niż sama liczba miRNA profilowanych z dużych platform opartych na sekwencjonowaniu. Ponadto, chociaż nie porównywaliśmy efektu wzbogacania miRNA z naszych próbek RNA, poprzednie doniesienia odradzały to, szczególnie w przypadku globalnych platform profilowania miRNA. Na przykład Redshaw i wsp. (2013) stwierdzili, że procedura wzbogacania krótkiego RNA skutkuje znacznie mniejszymi względnymi poziomami miRNA podczas porównywania całkowitego RNA i wzbogaconego materiału, a konkretnie procedura wzbogacania zmniejszyła liczbę kopii miRNA nawet o 25% liczby obecnej z próbek wstępnie wzbogaconych i że ta utrata różniła się dla różnych sekwencji miRNA. Dlatego dane dotyczące miRNA z preparatów całkowitego i krótkiego RNA mogą nie być bezpośrednio porównywalne. Co więcej, sugeruje się, że większe RNA może działać jako nośnik dla małych RNA. Czy metody wzbogacone w miRNA dla wszystkich firm spowodują lepszy odzysk z tkanek, pozostaje do ustalenia. Chociaż Bioline proponuje oddzielny zestaw do izolacji miRNA, użyliśmy zestawu Isolate II total RNA do bezpośredniego porównania z innymi metodami ekstrakcji, ponieważ ten specyficzny dla miRNA zestaw nie pozwala na izolację zarówno krótkiego, jak i długiego RNA z tej samej elucji. Raczej gatunki miRNA są wzbogacane i izolowane w pierwszej kolejności, a następnie długie RNA mogą być ekstrahowane później, co daje dwie oddzielne frakcje. Chociaż Isolate II nie jest zoptymalizowany do izolacji małych RNA tak jak zestawy miRVana lub miRNeasy, nie był on również lepszy pod względem ekspresji genów docelowych. Biorąc pod uwagę duże rozbieżności pomiędzy niektórymi zestawami, badacze powinni zdecydować się na bardziej solidną metodę ekstrakcji.