The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complexes involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiprotein complexes in sperm capacitation and ZP interaction

Po dotarciu do miejsca zapłodnienia, ampulli, plemniki muszą przeniknąć przez dwie bariery zanim połączą się z błoną plazmatyczną oocytu, czyli oolemą. Pierwsz± z nich jest bogata w kwas hialuronowy warstwa komórek cumulus otaczaj±ca oocyt, drug± – macierz zewn±trzkomórkowa samego oocytu, ZP (Hartmann i wsp. 1972). Pomimo powstania miejsc wi±ż±cych ZP i kwas hialuronowy w trakcie spermatogenezy oraz nabycia potencjału wi±ż±cego w trakcie przechodzenia plemników przez najądrze, komórki te wymagaj± odrębnego okresu pobytu w żeńskich drogach rodnych, zanim będ± w stanie z powodzeniem uczestniczyć w takich interakcjach (Austin 1951, Chang 1951). Zbiorowe zmiany, którym plemniki ulegają w tym środowisku, określane mianem kapacytacji, umożliwiają komórkom odpowiedź na sygnały pochodzące z kompleksu cumulus-oocyt i zakończenie procesu egzocytozy akrosomalnej, czyniąc je kompetentnymi do fuzji z oolemą.

W większości ssaków euteryjskich uważa się, że kapacytacja plemników jest inicjowana przez aktywację szlaku opartego na cAMP, który kończy się fosforylacją tyrozyny wielu białek plemnikowych (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). Wśród tych białek wyróżniają się chaperony molekularne, a HSP90AA1, HSP90B1 i HSPD1 należą do białek, które wykazują fosforylację tyrozyny w konsekwencji kapacytacji (Ecroyd i wsp. 2003, Asquith i wsp. 2004). Obecne modele sugeruj±, że fosforylacja tych chaperonów podczas kapacytacji wyzwala ich aktywn± rolę w składaniu białek rozpoznaj±cych ZP w kompleksy i/lub translokacji tych kompleksów na powierzchnię plemników w przygotowaniu do zapłodnienia (Ecroyd i wsp. 2003, Asquith i wsp. 2004, Nixon i wsp. 2005, Gadella 2008). Oprócz tej pośredniej roli w adhezji gamet, chaperony powierzchniowe plemników pełnią również funkcje cząsteczek adhezyjnych, które pośredniczą w rozpoznawaniu sulfoglikolipidów podczas wiązania gamet (Boulanger i wsp. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Ostatnio technika niebieskiego natywnego PAGE (BN-PAGE), która została pierwotnie opracowana do analizy kompleksów multienzymatycznych łańcucha transportu elektronów (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), została zaadaptowana do oceny multimerycznych kompleksów powierzchni plemników u myszy i ludzi (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Technika ta pozwala na elektroforetyczną rozdzielczość natywnych kompleksów białkowych, które zachowują swoją aktywność biologiczną. W plemnikach ludzkich i mysich, zastosowanie BN-PAGE równolegle z Far-Western blottingiem z całymi rozpuszczonymi zonami ujawniło kilka pierwotnych kompleksów wielobiałkowych, które posiadają powinowactwo do homologicznych ZP (Dun i wsp. 2011, Redgrove i wsp. 2011).

Jeden z takich kompleksów składa się z białkowych składników kompleksu CCT/TRiC (CCT1-CCT8), struktury dwupierścieniowej, która funkcjonuje jako chaperon molekularny odgrywający kluczową rolę w regulacji tworzenia kompleksów wielobiałkowych (Feldman i wsp. 1999, Guenther i wsp. 2002). Dowody w postaci testów koimmunoprecypitacji, kolokalizacji i ligacji zbliżeniowej zidentyfikowały białko wiążące ZP 2 (ZPBP2) jako jedno z najbardziej przekonujących białek klienckich dla kompleksu CCT/TRiC w dojrzałych plemnikach (Dun i wsp. 2011, Redgrove i wsp. 2011). Badania wykazały, że myszy pozbawione ZPBP2 są bezpłodne i wykazują defekty w interakcji z ZP i penetracji (Lin i wsp. 2007). U myszy istnieją dodatkowe dowody na to, że niektóre podjednostki kompleksu CCT/TRiC są translokowane na powierzchnię plemników podczas kapacytacji (Dun et al. 2011).

Inną znaczącą klasą chaperonów, która została zidentyfikowana na powierzchni plemników i zaangażowana w regulację interakcji z ZP jest rodzina HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Podobnie jak w przypadku kompleksu CCT/TRiC, chaperony z rodziny HSP70 mają również dobrze udokumentowaną rolę w ułatwianiu transportu białek transmembranowych i tworzeniu stabilnych kompleksów białkowych (Mayer & Bukau 2005). Jeden z członków rodziny HSP70, który wykazuje wyłączną (mysz) lub dominującą (człowiek) ekspresję w jądrach, wydaje się być niezbędny dla męskiej płodności. Rzeczywiście, nieprawidłowa ekspresja tego chaperonu, HSPA2, została skorelowana z fenotypem ciężkiej niepłodności czynnika męskiego u ludzi, szczególnie wpływając na zdolność plemników do interakcji z homogennymi oocytami in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Zarówno u myszy, jak i u ludzi, HSPA2 odgrywa fundamentalną rolę w spermatogenezie, a celowa delecja tego białka u tych pierwszych gatunków prowadzi do wczesnego zatrzymania tego procesu i jednoczesnego braku plemników (Eddy 1999). U ludzi, poziomy ekspresji HSPA2 zostały pozytywnie skorelowane z sukcesem zapłodnienia in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) i stąd rzekomo są w stanie przewidzieć status płodności mężczyzn z wysokim stopniem dokładności (Ergur et al. 2002).

Charakteryzacja HSPA2 w naszym własnym laboratorium ujawniła, że ten chaperon jest obecny w domenie akrosomalnej ludzkich plemników i jest składnikiem co najmniej pięciu kompleksów białkowych o wysokiej masie cząsteczkowej (Redgrove i wsp. 2012), w tym podzbioru tych, które wcześniej wykazały powinowactwo do ZP (Redgrove i wsp. 2011). Zgodnie z tymi danymi, uzyskaliśmy dowody, że najbardziej dominujący z kompleksów HSPA2 zawiera dwa dodatkowe białka, z których oba były wcześniej zaangażowane w interakcje plemnik-zona (Redgrove i wsp. 2012). Ponadto, zgodnie z opublikowanymi wynikami Huszar i wsp., udało nam się wykazać znaczące obniżenie poziomu HSPA2 w plemnikach mężczyzn z izolowanymi zmianami w ich zdolności do angażowania się w interakcje z ZP homologicznych oocytów in vitro (Redgrove i wsp. 2012). Nasze obecne prace koncentrują się na tym, czy deficyt w adhezji ZP wynika z nieprawidłowego tworzenia miejsc wiązania ZP we wczesnych etapach spermiogenezy (Huszar i wsp. 2000) lub może być wynikiem niezdolności HSPA2 do udziału w zdarzeniach przebudowy powierzchni plemników podczas kapacytacji, takich jak ułatwianie montażu i / lub prezentacji receptorów ZP na powierzchni plemników w przygotowaniu do interakcji z ZP.

W uzupełnieniu do naszej własnej pracy nad montażem kompleksów powierzchni plemników, Han i wsp. niezależnie zidentyfikowali alternatywny kompleks wielobiałkowy obciążony chaperonem na powierzchni plemników myszy. Co ciekawe, jak udokumentowano powyżej, kompleks ten, składający się z HSPA5, kaleksyny, integralnego białka błonowego 2B i ADAM7, jest najwyraźniej montowany podczas kapacytacji (Han i wsp. 2011). Podczas gdy funkcja tego kompleksu nie została jeszcze w pełni wyjaśniona, ekspresja ADAM7 została powiązana z obecnością dodatkowych białek ADAM, ADAM2 i ADAM3 (Kim i wsp. 2006), które są ważne dla adhezji plemników do ZP (Muro & Okabe 2011). Ponadto wiadomo, że HSPA5 jest zaangażowany w promowanie adhezji wysokiej jakości plemników do komórek nabłonka jajowodu (OEC) w cieśni żeńskiego układu rozrodczego. Uważa się, że tworzenie tego rezerwuaru ma działanie pro-życiowe, polegające na utrzymywaniu plemników w stanie niekapsułkowania, w przygotowaniu do uwolnienia oocytu do ampułki (Topfer-Petersen i wsp. 2002). Co ciekawe, chaperony HSPD1 i HSPA5 zostały również zlokalizowane na powierzchni bydlęcych OEC i w ten sposób zostały włączone do wiązania plemnik-OEC (Boilard i wsp. 2004).

Zgodnie z naszą własną pracą, kompleks zidentyfikowany przez Han i wsp. wykazano, że rezyduje on w mikrodomenach błonowych lub tratwach lipidowych, wyspecjalizowanych regionach błony, które stanowią platformę dla funkcjonalnego montażu i prezentacji kompleksów wielobiałkowych (Stein i wsp. 2006, Nixon i wsp. 2009, Han i wsp. 2011). Wydzielanie kompleksów chaperonowych do środowiska tratw zaobserwowano również dla HSPA2 w plemnikach ludzkich (Nixon i wsp. 2011) oraz dla komponentów kompleksu CCT/TRiC w plemnikach myszy (Dun i wsp. 2011). W tych domenach błonowych znajduje się również szereg dodatkowych, przypuszczalnych białek receptorowych ZP, w tym GALT1, ZP3R i SPAM1, co wzmacnia ich rolę w przebudowie powierzchni plemników i wiązaniu ZP (ryc. 1; Nixon i wsp. 2009, Asano i wsp. 2010). Mechanizm(y), za pomocą którego takie białka są rekrutowane do tratw lipidowych, nie został jeszcze rozwiązany; jednak doniesiono, że HSPA2 wiąże się poprzez swoją domenę ATPazy z 3′sulfogalaktozyloglicerolipidem, główną glikoproteiną zidentyfikowaną w obrębie tratw lipidowych plemników (Mamelak & Lingwood 2001).

Oprócz putatywnej roli tratw lipidowych w repozycjonowaniu kluczowych kompleksów chaperonów i białek receptorowych ZP, istnieją również przekonujące dowody, że wiele putatywnych receptorów ZP, takich jak ARSA i ZP3R, jak również kilka chaperonów molekularnych wykazuje zależną od kapacytacji relokację z miejsc wewnątrzkomórkowych, takich jak akrosom, na powierzchnię plemnika w celu przygotowania komórek przed ich interakcją z ZP (Nixon i in. 2009). Zaproponowano, że w intymnym kontakcie między zewnętrzną błoną akrosomalną a błoną plazmatyczną plemnika pośredniczy wiązanie komplementarnych białek receptora białka przyłączającego rozpuszczalny czynnik wrażliwy na N-etylmaleimid (SNARE), prowadząc do powstania porów fuzyjnych, które zapewniają drogę migracji enzymów na powierzchnię plemnika przed całkowitą utratą zawartości akrosomalnej (Søgaard i wsp. 1994, Blas i wsp. 2005, Tsai i wsp. 2007). Na poparcie tego modelu badanie przeprowadzone przez Brahmaraju i wsp. (2004) wykazało, że podanie przeciwciał przeciwko VAMP i SNAP do pęcherzyka akrosomalnego hamowało wiązanie spermy z ZP u myszy.

Ta postępująca priming powierzchni plemnika wywołała pytania dotyczące charakteru egzocytozy akrosomalnej typu „wszystko albo nic”. Niemniej jednak, funkcjonalny montaż kompleksów SNARE wydaje się również leżeć u podstaw przedłużonego procesu fuzji błony plemnika, który umożliwia całkowitą utratę zawartości akrosomalnej (Tsai i wsp. 2010). Chociaż powszechnie uważa się, że kontakt z ZP inicjuje egzocytozę akrosomalną u większości gatunków ssaków, szereg badań przeprowadzonych na myszach wykazało, że plemniki, które rozpoczynają egzocytozę akrosomalną przed kontaktem z ZP, są nadal zdolne do zapłodnienia komórki jajowej (Nakanishi i wsp. 1999, Jin i wsp. 2011). Zjawisko to może dotyczyć również plemników świnki morskiej (Huang i wsp. 1981) i chomika (Yanagimachi & Phillips 1984). Wyniki te sugerują istotną rolę cumulus oophorus w inicjacji reakcji akrosomowej i budzą obawy co do możliwości dokładnego opisania prawdziwej natury reakcji akrosomowej i interakcji ZP w badaniach in vitro prowadzonych z użyciem struktur zony oocytu pozbawionych cumulusu.

Niezależnie od takich kontrowersji, cząsteczki podobne do chaperonów zostały również zaangażowane w egzocytozę akrosomalną dzięki ich zdolności do promowania łączenia SNARE zawierających glutaminę (Q-SNARE) i SNARES zawierających argininę (T-SNARE) w ciasne trójskładnikowe kompleksy (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Co ciekawe, eleganckie badania na świniach wykazały, że kapacytacja indukuje stabilne dokowanie błony plazmatycznej plemnika z zewnętrzną błoną akrosomalną w przygotowaniu do zapłodnienia (Tsai i wsp. 2010). Nowsze badania przeprowadzone przez Tsai i wsp. (2012) również dostarczyły dowodów na obecność mieszanych pęcherzyków jednocząsteczkowych, które, oprócz innych ważnych funkcji, umożliwiają rekrutację wtórnych białek wiążących ZP na powierzchni plemnika i posiadają nowy trimeryczny kompleks SNARE składający się z syntaksyny 3, SNAP23, VAMP2 i dodatkowego białka, kompleksyny 2. Energia uwalniana podczas tworzenia takich kompleksów jest z kolei wykorzystywana do zainicjowania fuzji błonowej poprzez ściągnięcie błony plazmatycznej i wewnętrznej błony akrosomalnej plemnika (Tomes i wsp. 2002). Zakończenie tego procesu jest krytyczne dla odsłonięcia domen plemnika, które biorą udział w dalszych etapach zapłodnienia: wiązaniu i fuzji oolemmy.