shRNA – Zastosowania – Czym jest shRNA, jak działa i jakie są jego zastosowania.

Co to jest shRNA i jak się go używa?

Sekwencje shRNA (short hairpin RNA) są zwykle kodowane w wektorze DNA, który może być wprowadzony do komórek poprzez transfekcję plazmidową lub wirusową. Cząsteczki shRNA można podzielić na dwie główne kategorie w oparciu o ich konstrukcje: proste shRNA z pętlą łodygi i shRNA dostosowane do mikroRNA. Prosty shRNA typu stem-loop jest często transkrybowany pod kontrolą promotora polimerazy RNA III (Pol III). Transkrypt o długości 50-70 nukleotydów tworzy strukturę łodygi-pętli składającej się z regionu 19-29 bp dwuniciowego RNA (łodyga) połączonego z regionem głównie jednoniciowego RNA (pętla) i dinukleotydowym 3′ overhangiem. Prosty shRNA typu łodyga-pętla jest transkrybowany w jądrze i wchodzi na szlak RNAi podobnie jak pre-mikroRNA. Dłuższy (> 250 nukleotydów) shRNA dostosowany do mikroRNA jest konstrukcją, która bardziej przypomina natywne cząsteczki pri-mikroRNA i składa się ze struktury łodygi shRNA, która może zawierać niedopasowania podobne do mikroRNA, połączonej pętlą i otoczonej 5′ i 3′ endogennymi sekwencjami mikroRNA. Dostosowane do mikroRNA shRNA, podobnie jak prosta spinka do włosów z pętlą, jest również transkrybowane w jądrze, ale uważa się, że wchodzi na ścieżkę RNAi wcześniej, podobnie jak endogenne pri-mikroRNA.

Technologie shRNA są oparte na DNA, co zapewnia elastyczność w projektowaniu wektora. Większość systemów shRNA opartych na wektorach zawiera wybieralny marker, aby umożliwić eliminację komórek, które nie zostały z powodzeniem poddane transfekcji lub transdukcji, oraz utrzymanie komórek z trwałym znokautowaniem genu. Kasety ekspresyjne shRNA mogą być również włączone do systemów wektorów wirusowych, włączając retrowirusy, wirusy adeno-asocjacyjne, adenowirusy i lentiwirusy, które pozwalają na stabilną integrację i ekspresję z genomu gospodarza. Te wirusowe strategie pozwalają na dostarczenie shRNA do linii komórkowych, które są oporne na transfekcję. Znaczniki fluorescencyjne (takie jak białko zielonej lub czerwonej fluorescencji) mogą być również dołączone w celu śledzenia komórek wyrażających shRNA. Na działanie shRNA ma wpływ wiele czynników, w tym wydajność transdukcji lub transfekcji, promotor napędzający ekspresję shRNA i modyfikacje epigenetyczne (które mogą prowadzić do wyciszenia ekspresji shRNA). Co więcej, wpływ każdego z tych czynników na wydajność wektora może się różnić w zależności od linii komórkowej lub typu komórki. Opcje SMARTchoice dotyczące promotorów i reporterów są dostępne, aby pomóc badaczom w wyborze optymalnych promotorów dla ekspresji shRNA i wyciszania genów. Wreszcie, gdy te kasety ekspresji shRNA są połączone z indukowalnymi promotorami, jak w przypadku SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA lub systemu wektorów TRIPZ, badacze mogą zaprojektować badania w celu czasowej i przestrzennej modulacji ekspresji genów .

Animacja wideo: Interferencja RNA

Jak shRNA jest dostarczane do komórki?

Istnieją dwie opcje dostarczania shRNA opartego na DNA do komórek. W przypadku plazmidów można zastosować typowe metody transfekcji, takie jak użycie lipidowych odczynników do transfekcji lub elektroporacja. Cząsteczki lentiwirusowe są doskonałym wyborem w przypadku trudnych do transfekcji komórek, a także w sytuacjach, gdy wymagana jest wysoka wydajność lub konieczne jest dostarczenie wielu konstruktów na komórkę. Większość nowoczesnych wektorów posiada wybiórcze markery, które pozwalają na selektywne zabijanie komórek w hodowli, które nie zostały z powodzeniem poddane transfekcji lub transdukcji, dzięki czemu można stworzyć czystą hodowlę.

Co wpływa na funkcję i specyficzność shRNA?

Optymalne znoszenie genów jest wymogiem powodzenia RNAi przy użyciu systemów shRNA. Racjonalne projektowanie sekwencji shRNA zostało w dużej mierze oparte na algorytmach opracowanych dla siRNA. Podczas gdy niektóre zasady projektowania siRNA mają zastosowanie do shRNA, bardziej wyrafinowane algorytmy projektowania shRNA prawdopodobnie poprawią wyciszanie genów docelowych przez shRNA w przyszłości. W celu przewidzenia funkcjonalnych sekwencji shRNA, algorytm SMARTvector™ shRNA firmy Dharmacon wybiera sekwencje docelowe na podstawie wielu kryteriów, w tym preferencji nukleotydów zależnych od pozycji, struktury drugorzędowej i profili stabilności termodynamicznej specyficznych dla rusztowania SMARTvector opartego na mikroRNA. Dodatkowo, algorytm SMARTvector zawiera kilka kryteriów zwiększających specyficzność.

Tak jak w przypadku siRNA, podejścia bioinformatyczne mogą być stosowane do tworzenia specyficznych dla celu shRNA przy jednoczesnym minimalizowaniu potencjału efektów poza celem. Wiadomo, że wysokie stężenie intermediatów wyciszania może przyczynić się do wystąpienia efektów poza celem, ale poziom intermediatów jest trudny do kontrolowania, gdy shRNA ulega egzogennej ekspresji. W kilku publikacjach udokumentowano dowody na to, że w określonych warunkach wysoki poziom ekspresji prostego shRNA typu stem-loop może wysycić endogenną ścieżkę RNAi i prowadzić do niezamierzonych fenotypów. Inne badania sugerują, że użycie shRNA dostosowanego do mikroRNA może zmniejszyć toksyczność komórkową dla eksperymentów RNAi in vivo, ponieważ te rusztowania są bardziej wydajnie przetwarzane zarówno przez Drosha-DGCR8, jak i Dicer .

zastosowanie shRNA

shRNA oferuje możliwość przedłużonego wyciszania genów. Transdukcja shRNA opartego na wirusach umożliwia dostęp do komórek, takich jak komórki pierwotne i neuronalne, które są trudne do transfekcji za pomocą tradycyjnych strategii opartych na kationowych lipidach. Wirusowe shRNA zostały również wykorzystane do oceny funkcji genów w skali całego genomu przy użyciu puli konstruktów wyciszających. Pooled lub arrayed screens są obecnie szeroko stosowane do wykonywania screenów o wysokiej wydajności w celu identyfikacji genów wymaganych w różnych procesach, takich jak przeżycie i proliferacja komórek nowotworowych, komponenty szlaków supresji nowotworów, modulatory zegara okołodobowego ssaków, supresory przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego, mediatory gospodarza replikacji HIV-1 oraz regulatory migracji komórek. Potęga badań przesiewowych RNAi została również rozszerzona na badania przesiewowe funkcji genów w modelach zwierzęcych w celu zbadania biologii in vivo.

Które narzędzie shRNA jest odpowiednie dla Twoich potrzeb?

Przewodnik wyboru shRNA

Oferujemy wybór odczynników i bibliotek shRNA. Ten szybki przewodnik wyboru pomoże określić najlepszą opcję dla Twoich potrzeb.

Featured Products

shRNA – Products

• Odczynniki oparte na wektorach lentiwirusowych do interferencji RNA.

SMARTvector Lentiviral shRNA

• Podejmuj mądre, świadome wybory w celu skutecznego wyciszania genów w komórkach zainteresowania.

SMARTvector Inducible shRNA

• Najbardziej zaawansowany i elastyczny jedno-wektorowy indukowalny shRNA dostępny do ściśle kontrolowanego wyciszania genów.

Poled Lentiviral Screening Libraries

• Zoptymalizowana konstrukcja wysokiej jakości puli, kompletne narzędzia do analizy i zwalidowane protokoły są niezbędne do osiągnięcia pomyślnego wyniku podczas badań przesiewowych z użyciem pooleled lentiviral libraries.

Featured Resources

shRNA – Resources

• Znajdź przewodniki po produktach, FAQs i więcej.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Tech Note

• Nota techniczna opisująca przepływ eksperymentalny shRNA SMARTchoice w komórkach zawiesinowych.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Platforma jest innowacyjnym systemem idealnie nadającym się do badań z wykorzystaniem RNAi.

GIPZ Lentiviral shRNA – Technical Manual

• Protokoły doświadczalne do knockdownu genów przy użyciu GIPZ lentiviral shRNA.

1. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2):281-297.
2. Kim, V.N. (2005) MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dice. Nature Reviews, Molecular Cell Biology 6(5):376-385.
3. Brummelkamp, T.R. et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567):550-553.
4. Paddison, P.J. et al. (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. PNAS 99(3):1443-1448.
5. Paul, C.P. et al. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20(5):505-508.
6. Silva, J.M. et al. (2005) Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics 37(11):1281-1288.
7. Hong, S. et al. (2007) Functional analysis of various promoters in lentiviral vectors at different stages of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Molecular Therapy 15(9):1630-1639.
8. Liu, Z. et al. (1997) A systematic comparison of relative promoter/enhancer activities in mammalian cell lines. Analytical Biochem. 246(1):150-152.
9. Ramezani, A. et al. (2000) Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Molecular Therapy 2(5):458-469.
10. Ying, M. et al. (2011) Kruppel-like family of transcription factor 9, a differentiation-associated transcription factor, suppresses Notch2 signaling and inhibits glioblastoma-initiating stem cells. Stem Cells 29(1):20-31.
11. Peng, J. et al. (2009) Jarid2/Jumonji coordinates control of PRC2 enzymatic activity and target gene occupancy in pluripotent cells. Cell 139(7):1290-1302.
12. Du, W. et al. (2010) Cytoplasmic FANCA-FANCC complex interacts and stabilizes the cytoplasm-dislocalized leukemic Nucleophosmin Protein (NPMc). Journal of Biological Chemistry 285(48):37436-37444.
13. Fellmann, C. et al. (2011) Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell 41(6):733-746.
14. Grimm, D. et al. (2006) Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/ short hairpin RNA pathways. Nature 441:537-541.
15. McBride, J.L. et al. (2008) Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS 105(15):5868-5873.
16. Siolas, D. et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature Biotechnology 23(2):227-231.
17. Gregory, R.I. et al. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and post-transcriptional gene silencing. Cell 123(4):631-640.
18. Luo, B. et al. (2008) Highly parallel identification of essential genes in cancer cells. PNAS 105(51):20380-20385.
19. Silva, J.M. et al. (2008) Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319(5863): 617-620.
20. Schlabach, M.R. et al. (2008) Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319(5863):620-624.
21. Mullenders, J. et al. (2009) Candidate biomarkers of response to an experimental cancer drug identified through a large-scale RNA interference genetic screen. Clinical Cancer Research 15(18):5811-5819.
22. Maier, B. et al. (2009) A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes and Development 23:708-718.
23. Gumireddy, K. et al. (2009) KLF17 is a negative regulator of epithelial-mesenchymal transition and metastasis in breast cancer. Nature Cell Biology 11(11):1297-1304.
24. Rato, S. et al. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in Jurkat T-cells. PLoS One 5(2):e9276.
25. Yeung, M.L. et al. (2009) A genome-wide short hairpin RNA screening of jurkat T-cells for human proteins contributing to productive HIV-1 replication. Journal of Biological Chemistry 284(29):19463-19473.
26. Smolen, G.A. et al. (2010) A genome-wide RNAi screen identifies multiple RSK-dependent regulators of cell migration. Genes and Development 24(23):2654- 2665.
27. Zender, L. et al. (2008) An oncogenomics-based in vivo RNAi screen identifies tumor suppressors in liver cancer. Cell 135(5):852-864.
28. Montgomery, R.L. et al. (2011) Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure. Circulation 124(14):1537-1547.