Początkowe problemyEdit
TermolabilnośćEdit
Wstępne zastosowanie rekombinaz FLP-FRT nie działało u ssaków. Białko FLP było termolabilne (denaturowane w podwyższonych temperaturach) i dlatego nie było użyteczne w modelu ssaków ze względu na podwyższone temperatury ciała tych systemów modelowych. Jednakże, ze względu na patenty i ograniczenia w stosowaniu rekombinacji Cre-Lox, podjęto intensywne działania w celu wyprodukowania bardziej termostabilnej kasety FLP-FRT. Jedne z pierwszych wyników zostały uzyskane przez Buchholza i wsp. (1997) poprzez wykorzystanie mutagenezy cyklicznej w Escherichia coli. W swoich badaniach autorzy transfekowali komórki E. coli dwoma plazmidami: jednym kodującym losowo zmutowane białka FLP za promotorem arabinozy i drugim zawierającym promotor genu lacZ w kasecie FRT. E. coli hodowano na płytkach z arabinozą w temperaturze 37 °C i 40 °C, a jeśli dochodziło do rekombinacji, ekspresja genu lacZ była osłabiona, a kolonie wydawały się białe. Z każdego pokolenia wybierano białe kolonie i hodowano je na nowych płytkach z arabinozą w tych samych temperaturach przez osiem pokoleń. Po potwierdzeniu rekombinacji metodą western-blotting i sekwencjonowaniu zmutowanych genów FLP, białko FLP ósmej generacji (FLPe) zostało transfekowane do hodowli komórkowych ssaków, a rekombinacja w komórkach ssaków została potwierdzona. Ten wariant FLP ma tylko 4 substytucje aminokwasowe: P2S, L33S, Y108N, i S294P.
Generowanie mozaiki genetycznejEdit
Mozaika genetyczna występuje w organizmie, gdy podobne typy komórek wyrażają różne fenotypy z powodu odmiennych genotypów w określonych loci. Mówiąc prościej, ma to miejsce, gdy jeden organizm zawiera różne genotypy, co jest zwykle rzadkie w przyrodzie. Jednakże, może to być łatwo (i problematycznie) wytworzone przy użyciu rekombinacji FLP-FRT. Jeśli w komórce znajdują się dwa różne miejsca FRT, a FLP jest obecny w odpowiednim stężeniu, kaseta FRT będzie nadal wycinana i wstawiana pomiędzy te dwa miejsca FRT. Proces ten będzie kontynuowany do momentu, gdy białka FLP spadną poniżej wymaganego stężenia, co spowoduje, że komórki w organizmie będą posiadały różne genotypy. Zostało to zaobserwowane od muszki owocowej do myszy i jest niedyskryminujące wobec specyficznych chromosomów (somatycznych i płciowych) lub typów komórek (somatycznych i zarodkowych).
Określanie linii komórkowychEdit
Przed publikacją Dymeckiego et al. (1998), rekombinaza Cre została użyta do mapowania losów komórkowych progenitorów neuronalnych u myszy przy użyciu promotora En2. Autorzy Dymecki i wsp. (1998) przypuszczali więc, że rekombinaza FLP może być wykorzystana w podobny sposób i z podobną skutecznością jak rekombinaza Cre u myszy. Autorzy stworzyli dwie transgeniczne linie mysie: neuronalną linię fuzyjną Wnt1::Flp oraz linię, która posiadała kasetę FRT flankującą 18. ekson tm1Cwr. Autorzy wybrali ten ekson do wycięcia, ponieważ jego wycięcie skutkuje fenotypem zerowym. Autorzy skojarzyli dwie linie i pozwolili potomstwu osiągnąć dorosłość, zanim zostało ono poświęcone. Ekstrakcję RNA przeprowadzono na tkance neuronalnej, mięśniowej, jelitowej i ogonowej. PCR z odwrotną transkrypcją i northern blotting potwierdziły wycięcie 18. eksonu tm1Cwr obficie w tkance mózgowej i umiarkowanie w tkance mięśniowej (z powodu komórek Scwhanna w mięśniu). Zgodnie z oczekiwaniami, wycinanie nie było widoczne w innych tkankach. Autorzy zaobserwowali równą, jeśli nie lepszą, wydajność rekombinazy FLP w określaniu losu komórek niż rekombinaza Cre.
W Drosophila melanogaster (Fruit Fly)Edit
Do tej pory rekombinaza Flp była wielokrotnie wykorzystywana w D. melanogaster. Porównanie rekombinazy Flp do rekombinazy Cre w D. melanogaster zostało opublikowane przez Frickenhaus i wsp. (2015). Autorzy Frickenhaus i wsp. (2015) mieli podwójny cel: scharakteryzować i porównać skuteczność „knock-out” rekombinaz Flp do „knock-out” rekombinaz Cre i knockdown RNAi oraz ujawnić funkcję cabeza (caz), ortologa muchy do FUS, w neuronach i tkance mięśniowej D. melanogaster. FUS jest silnie związana ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) i demencją czołowo-skroniową u ludzi. Autorzy użyli systemu elav-Gal4/UAS-Flp lub Cre do ekspresji rekombinaz specyficznie w neuronach i systemu Mef2-Gal4/UAS-Flp lub Cre do ekspresji specyficznie w mięśniach. Autorzy doszli do wniosku, że narzędzie „knock-out” z rekombinazą Flp jest bardziej efektywne niż zarówno rekombinaza RNAi, jak i Cre w celu wybijania specyficznych genów w specyficznych tkankach lub liniach komórkowych, ze względu na brak nieszczelnej ekspresji obserwowanej zarówno w przypadku białka Cre, jak i transkryptu RNAi. Autorzy zaobserwowali również toksyczność białka Cre, której nie zaobserwowano w przypadku białka Flp.
W Danio rerio (Zebrafish)
Efektywność systemu rekombinacji FLPe została oceniona u rybek zebrafish przez Wong et al. (2009). Embriony, które były hemizygotyczne dla FRT-flanked enhanced green fluorescent protein (EGFP) downstream of a muscle-specific promotor, zostały wstrzyknięte z białkiem FLPe. Bez FLPe, zarodki te powinny wykazywać ekspresję EGFP we wszystkich tkankach mięśniowych, a w przypadku skrzyżowania z osobnikiem typu dzikiego, 50% otrzymanego potomstwa powinno również wykazywać ekspresję EGFP w tkance mięśniowej. Zarodki, którym wstrzyknięto FLPe, miały znacznie obniżoną ekspresję EGFP w tkance mięśniowej, zaobserwowano również mozaicyzm. Gdy zarodki te osiągnęły dorosłość, kojarzono je ze szczepem typu dzikiego, a w uzyskanych w ten sposób rodowodach było znacznie mniej potomstwa wykazującego ekspresję EGFP w tkance mięśniowej (0-4%). Wyniki te pokazują, że FLPe jest nie tylko wysoce skuteczny w komórkach somatycznych, ale jest również wysoce skuteczny w linii zarodkowej ryb zebrafish,
W roślinachEdit
Tworzenie „fitosensorów” lub „czujników” w Arabidopsis thaliana i TobaccoEdit
Fitosensory to genetycznie zmodyfikowane rośliny, które mogą informować o obecności biotycznych lub abiotycznych zanieczyszczeń. Oczywiście, produkcja tych zmodyfikowanych roślin jest bardzo obiecująca dla rolnictwa i laboratoriów. Jednak stworzenie odpowiedniego wektora reporterowego okazało się problematyczne. Elementy cis-regulacyjne odgrywają główną rolę w transkrypcyjnej aktywacji genów w roślinach, a wiele z nich nie jest dobrze poznanych. Wiele fitosensorów albo wykazuje zbyt niską ekspresję swoich genów reporterowych, albo zgłasza wyniki fałszywie dodatnie z powodu syntetycznych promotorów. Autorzy Rao i wsp. (2010) wykorzystali narzędzie rekombinazowe FLP do produkcji wysoce wydajnych fitosensorów. Autorzy wykorzystali promotor szoku termicznego do indukcji produkcji FLP, podczas gdy wektor FRT-flanked oddzielił promotor CaMV 35S od genu beta-glukuronidazy (GUS). Gdy rośliny zostały poddane szokowi termicznemu, indukcja FLP doprowadziła do usunięcia wektora otoczonego FRT, skutecznie przenosząc gen GUS bezpośrednio za promotor CaMV 35S. Aktywacja GUS doprowadziła do zmiany koloru liści roślin z zielonego na niebieski; w ten sposób fitosensor skutecznie informował o stresie w systemie modelowym!
Z Cre-rekombinaząEdit
Produkcja systemu ekspresji indukowanego MiRNA (GRIM) gotowego do przejścia przez bramęEdit
Interferencja RNA (RNAi) spowodowała zmianę paradygmatu w ekspresji genów i potencjalnym nokaucie genów u Eukariota. Przed wyprodukowaniem systemu ekspresyjnego GRIM, tworzenie wektorów RNAi było drogie i czasochłonne. Wektory były produkowane tradycyjną metodą klonowania molekularnego „kopiuj-wklej”. Garwick-Coppens i wsp. (2011) opracowali znacznie bardziej wydajną metodę produkcji wektorów RNAi, w której ekspresja RNAi może być knocked-in przy użyciu Cre-rekombinaza i knocked-out przy użyciu Flp-rekombinaza. Nowatorski GRIM Expression System pozwala na znacznie szybsze generowanie wektorów ekspresyjnych zawierających sztuczne konstrukty RNAi. Autorzy wykazali, że ich system ekspresji działa dość efektywnie w komórkach ludzkich nerek embrionalnych (HEK), powszechnie stosowanej w badaniach molekularnych ludzkiej unieśmiertelnionej linii komórkowej.
.