26.3.1.1 Receptory T1R: Transdukcja smaku słodkiego i umami
Pierwszymi receptorami metabotropowymi zidentyfikowanymi w odczuwaniu smaku byli dwaj członkowie rodziny T1R, T1R1 i T1R2 (pierwotnie nazwane TR1 i TR2),41 i zostały one odkryte za pomocą technik przesiewowych subtrakcji i różnicowania pojedynczych komórek. Receptory te wykazują około 40% homologii między sobą i są daleko spokrewnione z innymi GPCR, takimi jak receptor wyczuwania wapnia, receptor feromonów V2R i metabotropowe receptory glutaminianowe. Wszystkie są członkami rodziny GPCR klasy C, a ich cechą wyróżniającą jest długa N-końcowa domena zewnątrzkomórkowa, znana jako domena Venus flytrap. Eksperymenty hybrydyzacji in situ wykazały, że receptory te ulegaj± ekspresji w 20-30% TRC w przednich i tylnych kubkach smakowych. Ponadto, są one obecne u prawie wszystkich kręgowców, ale nie u bezkręgowców.39
Pocz±tkowo ligandy dla tych receptorów nie były znane, chociaż na podstawie ich ekspresji w przedniej czę¶ci języka sugerowano słodką transdukcję. Wiele osób spekulowało, że geny tych receptorów będą mapowane na locus sac, region na dystalnym chromosomie 4, wcześniej zidentyfikowany przez badania genetyczne jako związany ze słodkim smakiem u myszy. Fuller,42 badając szczepy myszy różniące się skłonnością do spożywania słodkich roztworów, ustalił, że większość różnic w preferencji sacharyny w szczepach smakujących i niesmakujących (odpowiednio C57BL/6J i DBA/2J) zależy od pojedynczego locus, zwanego sac. Dominująca forma allelu jest skorelowana z ostrzejszą preferencją. Późniejsze badania uogólniły to odkrycie na dodatkowe słodkie cząsteczki, takie jak acesulfam, dulcyna i sacharoza,43,44 i zauważyły, że przypuszczalne polimorfizmy w genach wpływają na aktywność nerwów obwodowych.45 Jednakże, przy użyciu mapowania genetycznego o wysokiej rozdzielczości, T1R1 mapuje się proksymalnie do locus sac.46
Tożsamość sac i jego związek z rodziną receptorów T1R stały się jasne po odkryciu trzeciego członka rodziny, T1R3.47-49 T1R3 ulega ekspresji zarówno w przednich, jak i tylnych polach TRCs, których morfologia jest zgodna z komórkami typu II. Ulega ona koekspresji z T1R1 lub T1R2, chociaż część TRCs wykazujących ekspresję T1R3 nie wykazuje koekspresji żadnego z nich.50 Komórki T1R3 ulegają koekspresji z innymi elementami kaskady słodkiej transdukcji, takimi jak α-gustducyna i PLCβ2. Eksperymenty z wykorzystaniem heterologicznych systemów ekspresji wykazały, że T1R3 wymaga koekspresji z T1R2, aby w pełni reagować na szeroką gamę słodkich substancji, takich jak cukry proste, sztuczne substancje słodzące, d-aminokwasy i słodkie białka.48,51 Ludzki dimer T1R2/T1R3 reagował na około dwadzieścia związków znanych jako słodkie w stężeniach fizjologicznych i był hamowany przez laktizol, ludzkiego antagonistę słodkiego smaku.51 Dzięki połączeniu mapowania fizycznego i eksploracji baz danych genomu, kilka grup zidentyfikowało T1R3 jako sac w genomach gryzoni i ludzi.47-49,51-54
Weryfikacja T1R2/T1R3 jako głównego receptora słodkiego smaku u ssaków została uzyskana w badaniach z wykorzystaniem myszy z nokautem dla genów T1R1, T1R2 lub T1R3, jak również myszy z podwójnym nokautem dla genów T1R2 i T1R3. Myszy te były badane za pomocą testów behawioralnych o krótkim dostępie oraz zapisów elektrofizjologicznych z nerwu przeponowego i nerwu ustno-gardłowego.55,56 Myszy T1R2-null wykazywały utratę preferencji i neuronalnych odpowiedzi na sztuczne substancje słodzące oraz znacznie zmniejszone odpowiedzi na cukry naturalne. Myszy T1R3-null straciły behawioralne i elektrofizjologiczne odpowiedzi zarówno na bodźce umami, jak i na sztuczne substancje słodzące oraz miały znacznie zmniejszone odpowiedzi na cukry. Tylko zwierzę z podwójnym nokautem całkowicie utraciło resztkowe odpowiedzi na naturalne cukry, co sugeruje, że T1R2 lub T1R3 mogą działać jako monomer lub homodimer. W rzeczywistości, komórki HEK-293 wykazujące ekspresję mysiej T1R3 same reagowały na wysoki cukier;50 co ciekawe, odpowiedzi tych nie obserwowano w przypadku ludzkiej T1R3. Badania te jednoznacznie wykazały istotną rolę białek T1R T1R2 i T1R3 w wykrywaniu i percepcji słodyczy. Podobnie, w fascynującym naturalnym nokaucie, rodzina Felidae nabyła mutację utraty funkcji w genie T1R2 na początku ewolucji i w konsekwencji utraciła słodki smak, co wyjaśnia obojętność kotów na cukier.57
Jak tak niewiele receptorów słodkiego smaku może wyjaśnić dużą liczbę gatunków i indywidualne różnice w percepcji słodkiego smaku? Różnice te mogą być wyjaśnione przez różnice w sekwencji genów pomiędzy gatunkami oraz przez polimorfizm w obrębie jednego gatunku. W heterologicznej ekspresji, tylko ludzkie T1R2/T1R3 reagowały na aspartam i cyklaminian, podczas gdy receptory pochodzące od szczura, który jest obojętny na te związki, nie reagowały.51 Co więcej, mysz T1R2-null wyrażająca ludzki transgen T1R2 wykazywała reakcje na kilka cząsteczek uznawanych przez ludzi za słodkie, na które myszy są obojętne.55 W obrębie gatunku, wiele polimorfizmów z kilku szczepów myszy wyraźnie asocjuje status degustatora i nie degustatora tych zwierząt.54,58 Polimorfizmy te nie działają poprzez blokowanie ekspresji genów lub translacji białek, ale raczej uważane są za zakłócające zdolność do tworzenia dimerów lub wiązania substancji słodzących. U ludzi polimorfizmy związane z promotorem T1R3 pomagają wyjaśnić dobrze znane różnice we wrażliwości smakowej na sacharozę.59
Innym paradoksem wynikającym z odkrycia słodkich receptorów jest to, że tak niewiele receptorów może rozpoznawać tak różnorodne bodźce, jak węglowodany, aminokwasy, białka i sztuczne substancje słodzące. Badania strukturalno-funkcjonalne tych receptorów zidentyfikowały wiele domen wiążących w obrębie kompleksu dimeru, co wyjaśnia, jak można sprostać tak wielkiej różnorodności.60,61 Na przykład domena Venus flytrap receptora T1R2 jest wymagana do wiązania aspartamu i neotamu, domena transmembranowa T1R3 jest wymagana do wiązania cyklaminianu,62,63 a region bogaty w cysteinę receptora T1R3 jest wymagany do reagowania na słodkie białko brazzeinę.64 Laktisol, antagonista słodyczy, wiąże się do kieszeni w obrębie transmembranowej domeny ludzkiego T1R3;65 co ciekawe, zmiana dwóch aminokwasów w transmembranowej 5 domenie receptora szczura wyjaśnia jego niewrażliwość na tego antagonistę.66 Do tej pory wszystkie cztery domeny dimeru T1R2/T1R3 – dwie domeny N-końcowe i dwie domeny transmembranowe – zostały zaangażowane w wiązanie ligandów, każda z nich z różnym powinowactwem do odpowiadających jej ligandów.
Wiele z tych samych strategii eksperymentalnych, które potwierdziły T1R2/T1R3 jako receptor słodki, podobnie potwierdziło T1R1/T1R3 jako receptor umami. Przy heterologicznej ekspresji ludzki dimer T1R1/T1R3 reaguje wybiórczo na l-glutaminian,51 podczas gdy dimer mysi jest bardziej rozwiązły wśród swoich ligandów, reagując na praktycznie wszystkie l- (ale nie d-) enancjomery 20 standardowych aminokwasów.48,67 Badania znokautowania dodatkowo dokumentują dimer T1R1/T1R3 jako receptor umami. Znokautowanie T1R1 lub T1R3 eliminuje behawioralne i elektrofizjologiczne odpowiedzi smakowe na glutaminian.55 Dodatkowo, charakterystyczną cechą smaku umami jest jego wzmocnienie przez rybonukleotydy, takie jak 5′-monofosforan inozyny (IMP) i 5′-monofosforan guanozyny (GMP). To wzmocnienie jest podobnie obserwowane w heterologicznej ekspresji i nieobecne u myszy z nokautem T1R1 lub T1R3. W przeciwieństwie do receptora smaku słodkiego, funkcjonalne domeny receptora umami są mniej zbadane. Wykorzystując receptory chimeryczne, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce wiązania oraz modelowanie molekularne, zaproponowano model kooperatywnego wiązania ligandów, w którym glutaminian wiąże się z domeną Venus flytrap receptora T1R1 (blisko regionu zawiasowego), a IMP wiąże się z sąsiednim miejscem stabilizującym zmianę konformacyjną.68
Nadal trwają dyskusje, czy dimer T1R1/T1R3 jest jedynym funkcjonalnym receptorem glutaminianu w TRC.50,69 Przed odkryciem rodziny T1R, unikalna okrojona forma receptora mGluR4 ulegająca ekspresji w TRCs została opisana jako receptor umami.70 Jednakże zwrócono uwagę, że receptor ten pozbawiony jest dużej części domeny Venus flytrap, która jest niezbędna do wiązania glutaminianu, oraz nie wykazuje synergizmu dla glutaminianu i rybonukleotydów.50 Cechy te czynią go mniej prawdopodobnym receptorem kandydującym dla umami. Niemniej jednak, trudności w rozdzieleniu odpowiedzi sodowej i glutaminianowej MSG, szczątkowe odpowiedzi umami u niektórych myszy z nokautem T1R3,56 i zmniejszenie odpowiedzi glutaminianowej na antagonistów mGluR71 pozostawiają otwartą kwestię wielu receptorów umami.